一株鴨源H6N6 亞型禽流感病毒的全基因組序列分析及對小鼠的感染性研究

范威峰，崔鵬飛，崔嘉琦，谷文麗，張元成，邢 鑫，孔興天，彭大新，鄧國華*，陳化蘭

（1.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，其表面糖蛋白為血凝素（Haemagglutinin, HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase,NA），共可劃分為16個HA亞型和9個NA亞型。1965年首次從火雞體內(nèi)分離到H6 亞型AIV，隨后在野鴨和其它多種水鳥中陸續(xù)分離到H6 亞型AIV[1]。1997年，在我國香港暴發(fā)人感染H5N1 亞型AIV 疫情期間，一株感染人的H5N1 亞型AIV（A/HongKong/156/97）的6 條內(nèi)部基因與一株H6N1 亞型AIV（A/teal/HongKong/W312/97）的核苷酸同源性大于98%，表面基因NA 與該H6N1 亞型AIV NA 基因同源性大于97%，提示該H6N1 亞型AIV 可能是H5N1 亞型AIV的基因供體[2]。2013 年我國臺灣出現(xiàn)首例人感染H6N1 亞型AIV，這也是人可以感染H6 亞型AIV 的直接證據(jù)[3]。H6 亞型AIV 對家禽呈低致病性，2010年法國火雞場暴發(fā)了H6N1 亞型禽流感疫情，表明H6 亞型AIV 對家禽的致病性有增強(qiáng)的趨勢[4]。本實(shí)驗室對2008 年～2011 年分離的257 株H6 亞型AIV 進(jìn)行系統(tǒng)研究，受體結(jié)合檢測結(jié)果顯示，有34%的病毒株（87/257）獲得了結(jié)合人源受體的能力，大部分病毒株（37/38）在沒有預(yù)先適應(yīng)的情況下就能在小鼠肺臟內(nèi)有效復(fù)制，其中部分病毒（5/10）還能夠在豚鼠間發(fā)生高效的接觸傳播[5]，這些事件表明H6 亞型AIV 具有跨越物種屏障感染人類并在人群間傳播的潛在風(fēng)險。因此，加強(qiáng)H6 亞型AIV 的監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

本研究對2015 年從廣東家鴨中分離的一株H6N6 亞型AIV 進(jìn)行全基因組測序、進(jìn)化分析和BALB/c 小鼠的感染性試驗，初步評價該分離株對哺乳動物的潛在風(fēng)險，為AIV 的監(jiān)測和禽流感防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實(shí)驗動物 病毒株DK/GD/S1182/2015（H6N6）由國家禽流感參考實(shí)驗室分離、鑒定并保存；10 日齡SPF 雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗動物中心；6 周齡雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司；Easy Taq DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司，測序反應(yīng)試劑盒Big Dye Terminator

3.1 購自美國ABI 公司。

1.3 病毒純化及雞胚半數(shù)感染量（EID50）的測定 將DK/GD/S1182/2015（H6N6）株病毒原液用PBS 10 倍倍比稀釋后接種于10 日齡SPF 雞胚，置于37 ℃培養(yǎng)72 h 之后4 ℃過夜，收取最高稀釋度、最高血凝價雞胚尿囊液，連續(xù)純化3 代之后，再10 倍倍比稀釋至105接種于10 日齡SPF 雞胚，用同樣方法收獲尿囊液將其分裝于凍存管中保存-70 ℃?zhèn)溆茫珽ID50按照常規(guī)方法進(jìn)行測定。

1.4 分離病毒的全基因組序列測定及分析 提取病毒核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，以其為模板，參照Hoffmann 等[6]的反應(yīng)條件和引物PCR 擴(kuò)增該分離株的各基因節(jié)段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，采用測序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator 3.1 對病毒全基因組序列測定，得到的基因序列經(jīng)SeqMan 軟件拼接，通過Blast 比對得到與DK/GD/S1182/2015（H6N6）株各基因節(jié)段同源性最高的病毒株，利用MEGA 6.0 軟件繪制HA 和NA 基因進(jìn)化樹。

1.5 小鼠的感染性試驗 選取6 周齡體質(zhì)量在15 g～16 g的BALB/c 雌性小鼠作為感染組和對照組。感染組8 只小鼠用干冰輕微麻醉后將DK/GD/S1182/2015（H6N6）株病毒以106EID50的劑量通過鼻腔感染，對照組5 只小鼠用相同方式接種50 μL PBS。3 d 后對感染組小鼠隨機(jī)挑選3 只迫殺，無菌采集其腦、鼻甲、脾臟、腎臟和肺臟后研磨、離心。取每只小鼠的各臟器上清10 倍倍比稀釋后接種10 日齡雞胚進(jìn)行臟器的病毒滴定，對照組和感染組剩余小鼠連續(xù)14 d 每天觀察并記錄體質(zhì)量變化情況。

2 結(jié)果和討論

2.1 分離病毒基因組序列測定及分析 將病毒株DK/GD/S1182/2015（H6N6）株的各基因節(jié)段經(jīng)PCR 擴(kuò)增后測序，得到的基因序列用SeqMan 軟件拼接，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫經(jīng)Blast 比對，得到與DK/GD/S1182/2015（H6N6）株各基因節(jié)段同源性最高的病毒株如表1 所示，表面基因HA 和NA 與在廣東分離的一株豬流感病毒（SIV）A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）核苷酸同源性最高，而內(nèi)部基因與廣西分離的一株AIV A/pigeon/Guangxi/164/2014（H6N6）核苷酸同源性最高（表1）。表明該病毒可能是由AIV 和SIV 重組產(chǎn)生，這種形式的重組可能會產(chǎn)生新的變異株引發(fā)新的流感大流行的潛在風(fēng)險。

2.1.1 HA 基因序列分析 分離的DK/GD/S1182/2015（H6N6）AIV 經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增獲得HA 表面基因，全長1 701 bp，編碼566 個氨基酸，HA 蛋白裂解位點(diǎn)處氨基酸為339PQIETR↓GL346，僅存在一個堿性氨基酸，符合低致病性AIV分子特征。HA蛋白含有7 個潛在糖基化位點(diǎn)，分別為26NNS28、27NST29、39NVT41、306NKT308、311NVS313、498NGT500和557NGS559。該 分 離 株 與受體結(jié)合特性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)為151L、183H、186I、190E、191Q、194L、196G、220R、222V、225G、226Q、227R、228S和229R，該分離株HA 蛋白與之前的H6 亞型AIV 相比具有A222V 和G228S 的突變，尤其G228S 的突變可以促進(jìn)H6 亞型AIV 對α-2, 6-唾液酸受體結(jié)合能力，而A222V 單獨(dú)突變時，對病毒的受體結(jié)合能力影響不大，當(dāng)這兩個突變同時存在時，對病毒受體結(jié)合能力的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)突變的影響，表明HA 蛋白氨基酸位點(diǎn)A222V 和G228S 的突變可能會使該病毒具備結(jié)合α-2,6-唾液酸受體的能力[7-9]。H6 亞型AIV 分為北美和歐亞兩個分支，該病毒HA 基因?qū)儆跉W亞分支（圖1），且與廣東分離的一株SIV A/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）株HA 基因核苷酸同源性最高，為98.5%，表明，DK/GD/S1182/2015（H6N6）株病毒表面基因HA 可能來源于SIVA/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）株，同時具備結(jié)合人類受體α-2, 6-唾液酸受體的能力。

表1 與病毒株A/DK/GD/S1182/2015（H6N6）各基因節(jié)段最高同源性的BLAST 分析Table 1 The BLAST analysis of genes of A/DK/GD/S1182/2015(H6N6)

圖1 A/DK/GD/S1182/2015(H6N6)分離株HA 基因進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic tree based on the hemagglutinin(HA)gene of the A/DK/GD/S1182/2015(H6N6)virus

2.1.2 NA 基因序列分析 DK/GD/S1182/2015（H6N6）病毒株NA 基因編碼區(qū)全長1 380 bp，編碼459 個氨基酸，潛在糖基化位點(diǎn)有6 個，分別為54NPT56、59NIT61、75NLT77、135NGT137、190NAS192和391NWS393，在NA 頸 部有11 個氨基酸缺失，NA 頸部氨基酸的缺失可能會增強(qiáng)該病毒與受體的結(jié)合特性[10]。流感病毒NA 頸部區(qū)域氨基酸序列和長度均具有較大的可變性，目前對NA 頸部和所在糖基化位點(diǎn)的缺失相關(guān)機(jī)制還不清楚，而且這種NA 頸部缺失在某些亞型病毒中較為普遍，有人認(rèn)為這可能是NA 酶活性在雞細(xì)胞中存在缺陷，而NA 頸部缺失在某種程度上可以彌補(bǔ)這種缺陷[9]，另種可能是先前水禽流感病毒在陸生家禽復(fù)制和傳播中NA 酶活性相對太高，而NA 頸部缺失會降低NA 酶活性，這均從側(cè)面表明這種NA頸部缺失可能是AIV 由水禽到陸生家禽的一種適應(yīng)性突變[11-12]。NA 亞型也分為北美和歐亞分支，該病毒NA 基因?qū)儆跉W亞分支（圖2），且與廣東分離的一株SIVA/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）株NA 基因同源性最高為98.3%，與該病毒NA 基因同源性較高的病毒以最近幾年的H5N6 亞型居多，表明H5 與H6亞型AIV 可能在豬體內(nèi)不斷重組。

2.1.3 內(nèi)部基因序列分析 內(nèi)部序列分析顯示，該分離株的聚合酶PB2 蛋白中并未出現(xiàn)與病毒傳播性和致病性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)627K 和701N 的突變[13-14]，在聚合酶PB1 和PA 蛋白中也未發(fā)現(xiàn)與病毒毒力相關(guān)的氨基酸436H（PB1）和515T（PA）的突變[15]。在M2 蛋白中也未出現(xiàn)抗金剛烷胺的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)27A 和31N的突變[16]，表明該病毒對金剛烷胺仍然敏感；但在NS1 蛋白中發(fā)生了與小鼠致病性增強(qiáng)相關(guān)的42S 和149A 氨基酸位點(diǎn)突變[17-18]，這表明該分離株對哺乳動物可能具有一定的致病力。

2.2 小鼠的感染性試驗結(jié)果 以106EID50病毒劑量通過鼻腔對BALB/c 小鼠進(jìn)行人工感染，小鼠并沒有表現(xiàn)明顯的臨床癥狀和體質(zhì)量下降，表明該分離株對小鼠呈現(xiàn)低致病性；臟器病毒滴定結(jié)果顯示，該分離株在沒有預(yù)先適應(yīng)的情況下就能夠在小鼠肺臟內(nèi)高效復(fù)制（圖3），這與之前王國俊等人的研究一致[5]。大量的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，H6 亞型AIV 的宿主范圍從水禽過渡到陸生家禽，同時還有文獻(xiàn)顯示其還能夠感染豬，甚至感染人的證據(jù)，這表明H6 亞型AIV 在進(jìn)化過程中不僅逐漸適應(yīng)了陸生家禽，同時也具有感染哺乳動物甚至人的能力。

圖2 A/DK/GD/S1182/2015（H6N6）分離株NA 基因進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on the neuraminidase(NA)gene of the A/DK/GD/S1182/2015(H6N6)virus

圖3 病毒感染后小鼠體質(zhì)量變化（A）和感染3 d 后臟器病毒滴定結(jié)果（B）Fig.3 Body weights of mice after inoculated with the virus(A)and virus titers in mice organs at 3 days post infection(B)

通過對DK/GD/S1182/2015（H6N6）株病毒進(jìn)化關(guān)系分析表明，該病毒株表面基因HA 和NA 與廣東分離的SIVA/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）株相應(yīng)基因核苷酸同源性最高，而內(nèi)部基因與廣西分離的AIVA/pigeon/Guangxi/164/2014（H6N6）株 同 源 性 最高，表明該病毒可能是SIV 和AIV 重組產(chǎn)生。豬作為流感病毒的“混合器”，對人流感和AIV 均易感，而SIVA/swine/Guangdong/K6/2010（H6N6）株最早來源于禽類，在感染豬期間發(fā)生了適應(yīng)性突變，尤其是在其HA 發(fā)生了G228S 的突變，該突變顯著增強(qiáng)病毒對α-2,6-唾液酸受體結(jié)合能力，如果這種突變病毒再回歸到禽類，無疑會增加AIV 對人類的感染風(fēng)險。雖然DK/GD/S1182/2015（H6N6）株病毒發(fā)生了G228S 的突變，但對哺乳動物模型小鼠仍呈低致病性，并沒有引起小鼠明顯的臨床癥狀和體質(zhì)量下降；臟器病毒滴定結(jié)果顯示，該病毒僅在小鼠肺臟復(fù)制，表明該病毒在哺乳動物中不具備傳播能力。自從2013 年發(fā)生人感染H6N1 亞型AIV 事件，表明H6 亞型AIV 已經(jīng)具有感染人的能力，因此，有必要繼續(xù)加強(qiáng)對H6 亞型AIV 的監(jiān)測及其相關(guān)生物學(xué)特性研究，為我國禽流感的監(jiān)測預(yù)警以及防控提供數(shù)據(jù)支持。