遲緩愛德華菌FliC-TolC 融合蛋白表達及免疫特性研究

張志強，杜萬年，王 苗，于秀劍，田占云，劉 晨，李昕甜，吳同壘，康元環(huán)，史秋梅*，劉 莉

（1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所 農業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室，浙江 湖州 313001；2.河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室河北科技師范學院，河北 秦皇島 066004；3.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林 長春 130118）

遲緩愛德華菌（Edwardsiellatarda），為腸桿菌科愛德華菌屬成員，能夠感染多種海洋魚類和陸生動物，引起包括敗血癥在內的多類型感染，已成為我國經(jīng)濟魚類養(yǎng)殖的重要病害之一[1]。

TolC 是存在于革蘭氏陰性菌外膜中的通道蛋白，較為保守，在細菌應對外界不利環(huán)境時發(fā)揮重要作用[2-5]。對沙門菌的研究表明，TolC 蛋白作為免疫原對沙門菌感染的動物具有優(yōu)良的保護效果[6]。本研究室前期對E. tarda 的TolC 蛋白進行相應研究發(fā)現(xiàn)，重組TolC 蛋白免疫小鼠具有優(yōu)良的免疫保護效果（實驗數(shù)據(jù)未發(fā)表）。而鞭毛蛋白FliC 在細菌運動、黏附和侵染宿主過程中發(fā)揮重要作用[4,7]，是細菌的重要毒力因子[5]。對鼠傷寒沙門菌的研究顯示，鞭毛蛋白是引起免疫反應的重要抗原成份之一[7]，同時鞭毛蛋白可以通過TLRS 通路誘導炎癥反應并促使樹突狀細胞成熟，增加抗原的遞呈效率，起到免疫佐劑的作用[7-8]。本實驗室前期對E. tarda 鞭毛蛋白FliC 的研究顯示，該蛋白具有較強的免疫原性和疫苗佐劑的特性[9]。那么將E. tarda 鞭毛蛋白FliC 與外膜蛋白TolC 融合表達，利用融合產(chǎn)物免疫動物是否具有更好的免疫效果？為此，本研究采用原核表達系統(tǒng)，對E. tarda 鞭毛蛋白FliC 與外膜蛋白TolC 進行融合表達，并評價其免疫效果，探索FliC-TolC 作為疫苗應用的潛力。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和實驗動物 致病性E. tarda ET-13分離株（哺乳動物源）由東南大學高大慶教授惠贈；ET-10 分離株（牙鲆源）、純化的E. tarda TolC 蛋白360 μμg/mL、FliC 蛋 白640 μμg/mL、pET-28a 原 核表達載體由河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室保存；E.coli DH5α、E.coli BL21感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。6 周齡～8 周齡清潔級昆明小鼠，購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所，在本實驗室自由采食1周，以適應環(huán)境。3 cm～5 cm斑馬魚購自秦皇島某花鳥市場，于實驗室養(yǎng)殖2周，以適應環(huán)境。

1.2 主要試劑 LATaq DNA 聚合酶購自TaKaRa 公司；BamHⅠ、SalⅠ及T4 連接酶均購自Thermo 公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒、His 標簽單克隆抗體（His-MAb）、山羊抗小鼠IgG-HRP 抗體（HRP-IgG）、eECL Western Blot Kit、IPTG 及Ni-Agargose Resin 購自康維世紀公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自OMEGA 公司。

1.3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank 登錄的E.tarda 參考菌株ET-1 基因組序列（CP001135.1）設計特異性引物擴增fliC-tolC 片段（表1）。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 PCR 擴增所用引物Table 1 The primer sequences for PCR amplification

1.4 重組原核表達載體的構建與鑒定 提取ET-10基因組，以其為模板，利用P1/P2、P3/P4，分別擴增fliC、tolC 基因片段；瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收特異性基因片段。將回收產(chǎn)物1∶100 稀釋后，按1∶1 摩爾比混合后作為融合PCR 模板，利用P1/P4 引物進行融合PCR，回收目的基因片段。目的片段經(jīng)BamHⅠ、SalⅠ雙酶切后克隆至pET-28a 載體中，構建重組質粒pET-28a-fliC-tolC。重組質粒經(jīng)PCR鑒定，并由上海生工生物工程技術服務有限公司測序鑒定。

1.5 重組FliC-TolC 融合蛋白的表達驗證、可溶性分析及純化 將鑒定的pET-28a-fliC-tolC 重組質粒和空載體，分別轉化入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中培養(yǎng)至OD600nm值為0.6～0.8；加入IPTG（至終濃度為1 mmol/L），37 ℃繼續(xù)誘導培養(yǎng)4 h；制備蛋白樣品[10]，以His-MAb 為一抗（1∶10 000），山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶20 000）為二抗，利用eECL western blot kit 鑒定目的蛋白的表達。

對重組菌株大體積誘導培養(yǎng)，超聲破碎菌體后分別收集上清液和沉淀。將誘導后菌液、超聲裂解上清液、超聲裂解沉淀分別制備蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE 檢測，分析目的蛋白的表達情況及表達形式。按Ni-Agargose Resin 蛋白純化說明純化目的蛋白[11]，利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒，測定目的蛋白純化濃度，于-70 ℃保存。

1.6 免疫小鼠血清抗體水平的檢測 參照文獻[12-13]利用小鼠模型評價FliC-TolC 蛋白的免疫效果。將健康昆明鼠隨機分成4 組，每組20 只。以純化的FliC-TolC、FliC、TolC 重組蛋白作為免疫原，免疫劑量分別為20 g/只、100 g/只、100 g/只。分別于第0、15 d、22 d 免疫，對照組為等體積PBS，將重組蛋白或PBS 添加一定比例的吐溫-80 和白油后乳化；乳化蛋白以頸背部皮下進行分點注射免疫。

在小鼠免疫后0 、15 d、22 d、29 d，尾尖采血并分離血清。利用間接ELISA[12-13]，以超聲破碎的E.tarda 全菌蛋白作為包被抗原[14]，檢測小鼠血清中抗體水平，以陰性血清OD450nm平均值+3SD 作為陰陽性臨界值，OD450nm值大于臨界值判定為陽性。

1.7 小鼠免疫保護實驗 三免后15 d 對全部小鼠腹腔接種ET-13 菌液，劑量為2 LD50（8.0×106cfu），感染后觀察96 h，統(tǒng)計各組小鼠死亡情況并計算攻毒保護率。

1.8 斑馬魚免疫保護實驗 利用斑馬魚模型評估重組FliC-TolC、FliC、TolC 蛋白對E.tarda 感染的免疫保護效果。將健康斑馬魚隨機分成4 組，每組20尾。將重組蛋白肌肉注射斑馬魚，每尾50 g，對照組注射等體積PBS；首免后第15 d 對實驗組斑馬魚腹腔接種感染ET-10，劑量為2 LD50（2×106cfu），感染后觀察4 d，統(tǒng)計各組斑馬魚攻毒死亡情況，計算攻毒保護率。

2 結 果

2.1 重組原核表達載體的構建與鑒定 以ET-10 基因組為模板經(jīng)PCR 分別擴增fliC、tolC 基因片段，結果顯示在1 000 bp、1 200 bp 處出現(xiàn)目的條帶，與預期一致（圖1）；二次融合PCR 在2 000 bp 處擴增出與預期大小一致的目的基因片段。將目的基因片段雙酶切后克隆至pET-28a 載體中，測序無突變和移碼，即得到重組表達載體pET-28a-fliC-tolC。

圖1 E.tarda 靶基因的PCR 擴增Fig.1 Amplification of the target genes from the genome of E.tarda by PCR

2.2 重組FliC-TolC融合蛋白的表達檢測、可溶性分析及純化 將重組載體pET-28a-fliC-tolC 轉化E.coli BL21（DE3）后誘導表達，SDS-PAGE 分析融合蛋白表達情況，結果顯示在78 ku 處出現(xiàn)目的蛋白條帶，而誘導的空載體菌體均無此蛋白條帶（圖2A）。Western blot 分析結果顯示，同樣于78 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖2A），表明FliC-TolC 重組融合蛋白正確表達。

對FliC-TolC 融合蛋白進行可溶性分析，SDSPAGE 分析結果顯示，菌體蛋白上清中出現(xiàn)較濃的特異蛋白質條帶，而沉淀中的重組蛋白含量比較低（圖2B），表明FliC-TolC 蛋白主要以可溶性表達。利用Ni-Agargose Resin 試劑盒純化得到純化FliCTolC 蛋白，測定FliC-TolC 蛋白濃度為66μμg/mL。

2.3 免疫小鼠血清抗體水平的檢測 將純化的FliCTolC、TolC、FliC 蛋白免疫小鼠，將4 次采集的血清按1∶200 稀釋后，采用間接ELISA 方法檢測特異性抗體水平。結果顯示，在免疫15 d 時，F(xiàn)liCTolC、TolC 蛋白免疫組抗體達到較高水平，而FliC蛋白免疫組略低于兩組；在免疫22 d 時，F(xiàn)liC-TolC蛋白免疫組產(chǎn)生特異性抗體明顯高于TolC 和FliC 蛋白免疫組（圖3）。表明FliC-TolC 蛋白具有良好的免疫原性。

圖2 FliC-TolC 蛋白表達的檢測（A）及可溶性分析（B）Fig.2 FliC-TolC protein expression and solubility analysis

圖3 免疫小鼠的抗體檢測結果Fig.3 Results of antibody titer detection in immunized mice

2.4 小鼠模型免疫保護實驗 將純化的FliC-TolC、TolC、FliC 蛋白免疫小鼠，并于3 免后15 d 對所有小鼠以2 LD50ET-13 活菌腹腔攻毒，96 h 內觀察并記錄每組小鼠的死亡情況。結果顯示：對照組小鼠相繼全部死亡，F(xiàn)liC-TolC、TolC、FliC 3 個蛋白免疫組小鼠，免疫保護率分別為95%、95%和65%（圖4）。表明FliC-TolC 融合蛋白對小鼠具有較好的免疫保護力。

2.5 斑馬魚模型免疫保護實驗 將純化的FliCTolC、TolC、FliC 蛋白肌肉注射免疫斑馬魚，于第15 d，以2 LD50ET-10 感染斑馬魚。結果顯示：對照組斑馬魚全部死亡，F(xiàn)liC-TolC、TolC、FliC 3 個蛋白免疫組均能夠在不同程度上保護斑馬魚免受E.tarda 感染。免疫保護率分別為60%、45%和30%（圖5）。表明重組FliC-TolC 融合蛋白能夠在一定程度上保護斑馬魚對抗E. tarda 感染。

圖4 FliC-TolC 蛋白對小鼠的免疫保護率Fig.4 Immune protection rate of FliC-TolC protein in mice

圖5 FliC-TolC 蛋白對斑馬魚的免疫保護率Fig.5 Immune protection rate of FliC-TolC protein in zebrafish

3 討 論

本研究利用融合PCR 方法擴增fliC-tolC 基因融合片段，進而構建表達載體。擴增結果顯示，該方法雖然會出現(xiàn)非特異性擴增，但經(jīng)膠回收后，產(chǎn)物完全能夠滿足后續(xù)試驗要求，同時該方法能夠避免酶切位點的限制，能夠較好的實現(xiàn)片段融合。

在設計FliC-TolC 融合表達時，本研究嘗試將fliC、tolC 開放閱讀框相連，構建表達載體后，雖無移碼和突變，但融合蛋白并未表達（SDS-PAGE 和western blot 數(shù)據(jù)未展示），推測是FliC、TolC 發(fā)生了相互干擾，影響了融合蛋白表達。因此，本研究在設計擴增融合基因時在兩個基因間插入了linker（GGGGS）的編碼基序，結果顯示，蛋白得到有效表達。

本實驗顯示所獲得的融合蛋白在上清表達，但在利用針對可溶性蛋白的Ni-Agargose Resin 試劑盒純化蛋白時，未能回收到純化的蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳顯示（圖略），蛋白存在于流穿液中，未能與Ni-Agargose Resin 結合。分析原因，可能是FliC 與TolC 蛋白在折疊過程中將His 標簽包裹起來。為此，本研究向上清中添加終濃度為8 mol/L 的尿素后純化，得到了純化蛋白。

本實驗室前期研究分別利用FliC 與TolC 蛋白免疫小鼠均展現(xiàn)良好的免疫效果[9]，其中TolC 蛋白免疫保護率可達95%。為了評價FliC-TolC 融合蛋白免疫效果，并比較其與單純TolC 蛋白和FliC 免疫差異，本研究降低了免疫蛋白劑量為20 g/只，結果顯示，F(xiàn)liC-TolC 融合蛋白免疫小鼠能夠產(chǎn)生較高水平抗體，明顯高于TolC 免疫組和FliC 免疫組。

本實驗利用動物模型對E. tarda FliC-TolC 融合蛋白免疫效果進行了進一步研究。E.tarda 是人獸共患病原，小鼠是其模式動物，因此首先測定了FliC-TolC、FliC、TolC 3 個蛋白對小鼠的免疫保護力，結果顯示，F(xiàn)liC-TolC 融合蛋白免疫保護力較高達到95%，也明顯高于TolC 免疫組和FliC 免疫組小鼠。與此同時，本研究利用斑馬魚模型進行了平行試驗，得到了類似的結果，融合蛋白對斑馬魚的免疫保護率為60%，高于TolC 免疫組和FliC 免疫組。

E.tarda 鞭毛蛋白FliC 與外膜蛋白TolC 均是該菌具有較好免疫保護效果的蛋白，其中鞭毛蛋白FliC兼具疫苗佐劑的特性[15]。本研究構建了E.tarda FliCTolC 融合蛋白，并對其免疫效果進行評價，證實了該融合蛋白能夠誘導高水平的體液免疫，對實驗動物具有優(yōu)良的免疫保護效果，為進一步研制E.tarda亞單位苗和活載體疫苗提供了參考。