皮下注射尼古丁對(duì)大鼠椎間盤退變的影響及其機(jī)制

吳磊磊，邱玉金，王學(xué)文，趙司順

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261000

研究顯示，機(jī)械應(yīng)力、損傷、基因突變、年齡、營(yíng)養(yǎng)等影響因素均會(huì)造成椎間盤退變[1]。椎間盤作為人體最大的無血管組織，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)缺乏，其營(yíng)養(yǎng)主要是通過椎間盤纖維環(huán)途經(jīng)和軟骨終板途徑被動(dòng)擴(kuò)散而來[2]，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散必須借助于水的擴(kuò)散來完成。水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式包括脂質(zhì)雙分子層的簡(jiǎn)單擴(kuò)散與通道介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，前者水?dāng)U散緩慢，而后者介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)速度快，不需要消耗能量，也不受門控機(jī)制的影響，這種通道就是水通道蛋白(AQPs)[3]。分布在人類椎間盤上的AQPs主要是AQP1和AQP3，二者共同維持椎間盤的含水量，保證椎間盤的營(yíng)養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可引起椎間盤軟骨終板的血管收縮變性，管壁肥厚，管腔狹窄，血流量減少，導(dǎo)致椎間盤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少，造成椎間盤退變。目前對(duì)于尼古丁在椎間盤退變過程中對(duì)AQPs的影響鮮有報(bào)道。我們對(duì)大鼠皮下注射尼古丁，觀察其椎間盤退變程度以及椎間盤組織中AQP1、AQP3蛋白的表達(dá)變化，探討尼古丁對(duì)椎間盤退變的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只，8～9周齡，體質(zhì)量200～300 g，購于濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。尼古丁購于上海友思生物技術(shù)有限公司，純度為98%，加入生理鹽水稀釋為2 mg/mL的溶液，冷凍保存，注射前1 h室溫解凍。AQP1多克隆抗體、AQP3多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、枸櫞酸鹽緩沖液、抗體稀釋液均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與給藥方法 將大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及對(duì)照組各10只。實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組腹部皮下注射尼古丁稀釋液1.5 mL/(kg·d)，對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)5周。

1.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照組于注射5周后、實(shí)驗(yàn)2組于注射10周后，腹腔注射10%水合氯醛處死。將大鼠置于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上俯臥位固定，背部正中切口，顯露L4/L5椎體，取出第4、5腰椎，蒸餾水洗凈，用小尖刀及眼科剪仔細(xì)剝離L4/L5椎間盤組織。常規(guī)石蠟包埋，橫向切片。

1.4 椎間盤退變程度觀察 采用HE染色法。取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素染色。加入1%鹽酸乙醇中分化10 s，自來水沖洗，1%酸性伊紅染液染色1 min。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。按照文獻(xiàn)[4]方法對(duì)椎間盤退變程度進(jìn)行分級(jí)。1級(jí)：纖維環(huán)中纖維輕微扭曲，可以見到纖維環(huán)輕度撕裂；2級(jí)：纖維環(huán)中纖維中度扭曲，可以見到纖維環(huán)撕裂；3級(jí)：纖維環(huán)中纖維重度扭曲，可以見到纖維輕微反折畸形；4級(jí)：纖維環(huán)中纖維嚴(yán)重的反向折疊輪廓，椎間盤纖維環(huán)撕裂；5級(jí)：椎間盤纖維環(huán)撕裂，纖維環(huán)輪廓模糊不清。

1.5 椎間盤組織AQP1、AQP3表達(dá)檢測(cè) 采用SABC免疫組織化學(xué)染色法。取石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。加入0.3% H2O2消除內(nèi)源性酶活性，熱抗原修復(fù)。滴加5% BSA封閉液(山羊血清封閉液)，室溫下反應(yīng)25 min；滴加一抗(AQP1、AQP3稀釋濃度均為1∶200)，4 ℃過夜，PBS沖洗。滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。滴加試劑SABC，37 ℃孵育25 min，PBS沖洗。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以細(xì)胞質(zhì)呈棕黃或棕褐染色為陽性。應(yīng)用IpWin51C圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽性表達(dá)的光密度值，每個(gè)椎間盤隨機(jī)選取2張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組椎間盤退變程度比較 對(duì)照組椎間盤各組織結(jié)構(gòu)清楚，纖維環(huán)的纖維排列致密、層次分明，纖維環(huán)與髓核界限清晰、連接緊密。實(shí)驗(yàn)1組椎間盤各組織結(jié)構(gòu)模糊紊亂，嚴(yán)重炎性水腫、黏液樣變性，纖維環(huán)的纖維出現(xiàn)撕裂、重度扭曲、反向折疊現(xiàn)象，局部模糊不清，纖維環(huán)與髓核連接處出現(xiàn)斷裂，60%為4級(jí)退變、35%為3級(jí)退變、5%為5級(jí)退變。實(shí)驗(yàn)2組椎間盤各組織結(jié)構(gòu)模糊紊亂，層次不清，椎間盤纖維環(huán)有不同程度基質(zhì)填充，但走形仍較紊亂、扭曲。

2.2 各組髓核組織AQP1、AQP3表達(dá)水平比較 見表1。

表1 各組AQP1、AQP3表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)1組比較，△P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可造成椎間盤退變[5]，降低脊柱疾病的治療效果。Iwahashi等[6]報(bào)道，尼古丁會(huì)造成椎間盤軟骨終板的血管芽變窄，管壁肥厚，管腔狹窄，微血管數(shù)量也明顯減少，使得局部血流量減少，氧分壓及氧飽和度明顯下降；Nasto等[5]發(fā)現(xiàn)吸煙抑制細(xì)胞DNA、蛋白多糖和膠原的合成，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的合成和釋放，加速細(xì)胞凋亡。這會(huì)嚴(yán)重干擾椎間盤營(yíng)養(yǎng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，造成椎間盤退變。Elmasry等[7]報(bào)道，吸煙會(huì)使椎間盤的營(yíng)養(yǎng)血管收縮變性，椎間盤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少，進(jìn)而黏多糖等成分合成減少，椎間盤發(fā)生退變。

髓核含水量下降是椎間盤退變的主要特征之一[8]，水分的丟失會(huì)影響椎間盤的營(yíng)養(yǎng)，進(jìn)而促進(jìn)椎間盤的退變。AQPs作為髓核細(xì)胞水分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道，在椎間盤髓核含水量的變化中具有至關(guān)重要的作用。Richardson等[9]報(bào)道，在健康人的椎間盤組織中，AQP1、AQP3在髓核和內(nèi)層纖維環(huán)中均有表達(dá)，外層纖維環(huán)中僅有少量AQP3表達(dá)，而椎間盤各結(jié)構(gòu)均未見AQP2表達(dá)。李健等[10]報(bào)道，人正常椎間盤的軟骨終板和髓核中均有AQP3表達(dá)，纖維環(huán)中無表達(dá)。表明人椎間盤中的水通道蛋白以AQP1與AQP3表達(dá)為主。本研究結(jié)果顯示，AQP1與AQP3在大鼠髓核及內(nèi)層纖維環(huán)中明顯表達(dá)。

本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)1組中，AQP1與AQP3在椎間盤內(nèi)均有表達(dá)，但是在實(shí)驗(yàn)1組中的髓核與內(nèi)層纖維環(huán)中AQP1、AQP3表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少。其原因可能與尼古丁引起炎性因子表達(dá)上調(diào)有關(guān)。尼古丁可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)[11]以及單核細(xì)胞分泌TNF-α[12]，這些炎性因子在椎間盤退變過程中起重要作用。曹國(guó)永等[13]對(duì)大鼠椎間盤軟骨終板細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)加入尼古丁后細(xì)胞中AQP1、AQP3表達(dá)減少，并具有濃度依賴性，認(rèn)為尼古丁對(duì)AQPs的表達(dá)具有明顯的抑制作用。

AQP1、AQP3是椎間盤水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道，AQP1、AQP3表達(dá)下降則椎間盤的水轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，進(jìn)出水分減少，伴隨著水轉(zhuǎn)運(yùn)而進(jìn)出細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)也會(huì)出現(xiàn)障礙，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)減少會(huì)造成細(xì)胞的功能障礙甚至凋亡；其次，水轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙還會(huì)導(dǎo)致椎間盤內(nèi)代謝廢物的積聚，無法盡快運(yùn)出細(xì)胞，損傷椎間盤細(xì)胞，造成椎間盤退變。此外，AQP1、AQP3表達(dá)減少還會(huì)造成對(duì)氧[14]、甘油[15]的攝取障礙，更進(jìn)一步造成椎間盤的營(yíng)養(yǎng)障礙。而椎間盤退變發(fā)生后，含水量減少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞受阻，椎間盤細(xì)胞的功能受到影響，AQP1、AQP3表達(dá)進(jìn)一步減少，從而形成惡性循環(huán)。

為了觀察去除尼古丁刺激后椎間盤的自我修復(fù)情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠模型在尼古丁稀釋液皮下注射5周后休養(yǎng)5周;結(jié)果顯示，椎間盤組織中AQP1、AQP3表達(dá)較尼古丁注射5周時(shí)有所增多，但與正常對(duì)照組比較差距仍十分明顯。說明去除尼古丁的損傷刺激后，椎間盤營(yíng)養(yǎng)及代謝的受抑制狀態(tài)逐漸解除，椎間盤細(xì)胞的功能有所恢復(fù)，AQPs合成明顯增多。但這種自主修復(fù)并不能完全逆轉(zhuǎn)椎間盤退變，而且這種修復(fù)是相當(dāng)緩慢的。

綜上所述，尼古丁持續(xù)攝入會(huì)造成大鼠健康椎間盤的退變加速；AQP1、AQP3在椎間盤退變過程中具有重要作用，其表達(dá)減少或活性降低有可能是椎間盤退變的始動(dòng)因素之一。