施今墨對(duì)藥配方對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟胰島素抵抗及PI3K/AKT/GSK-3β信號(hào)通路的影響

代紫陽(yáng)，董玉山，李繼安，王亞，常宏，杜晨光

華北理工大學(xué)，河北唐山063210

2型糖尿病(T2DM)發(fā)病率高、并發(fā)癥多，已對(duì)全球人類健康造成嚴(yán)重威脅。胰島素抵抗是T2DM基礎(chǔ)發(fā)病機(jī)制，肝臟、肌肉及脂肪為胰島素抵抗的主要靶組織，其中肝細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗時(shí)肝糖原合成減少、分解增加并進(jìn)一步加重糖代謝紊亂[1]，因此，改善肝細(xì)胞胰島素抵抗也是T2DM新藥開(kāi)發(fā)的重要方面。不同于靶向單一的化學(xué)降糖藥物，中藥多具備多靶點(diǎn)、多層次綜合調(diào)節(jié)和治療作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，T2DM是本虛標(biāo)實(shí)之病。T2DM初期既有肺胃郁熱，又有脾腎虧虛，宜采取清肺胃、補(bǔ)脾腎、化痰濁的治療原則。本課題組以施今墨先生“降糖對(duì)藥”為基礎(chǔ)，擬定了施今墨對(duì)藥配方，經(jīng)過(guò)臨床應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)該配方可明顯減輕T2DM患者胰島素抵抗。2018年3月～2019年12月，我們觀察了施今墨對(duì)藥配方對(duì)T2DM大鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/AKT/GSK-3β的影響，探討該方提高糖原含量、減輕肝臟胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量(180±10)g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于溫度20 ℃、相對(duì)濕度45%環(huán)境，12 h/12 h光暗周期，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 干預(yù)藥物 施今墨對(duì)藥配方為黃連10 g、肉桂6 g、天花粉6 g、桑白皮10 g、黃芪6 g、生地6 g、丹參6 g、葛根6 g、菟絲子20 g、萊菔子20 g、五味子15 g、厚樸6 g、玄參6 g、蒼術(shù)6 g，購(gòu)于北京同仁堂唐山連鎖藥店有限公司。加入8倍量水煎煮2 h，共煎煮2次，將2次藥液混合，加熱濃縮成混懸液，4 ℃冰箱保存。

1.1.3 試劑與儀器 C肽、胰島素檢測(cè)試盒購(gòu)自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司；肝/肌糖原試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。單克隆抗體PI3K、多克隆抗體AKT、單克隆抗體p-AKT(Ser473) 、單克隆抗體GSK-3β、多克隆抗體p-GSK-3β(Ser9)均購(gòu)自Cell Signaling公司。單克隆抗體p-PI3K p85/p55 (Tyr467, Tyr199)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠單克隆抗體IgG、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。穩(wěn)益血糖儀、血糖試條(三諾生物傳感股份有限公司)；M200PRO型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.2 動(dòng)物分組與模型制作 將大鼠隨機(jī)分成糖尿病組34只和正常對(duì)照組6只，糖尿病組給予5%葡萄糖飲水、高脂飼料喂養(yǎng)4周，正常對(duì)照組給予純凈水、普通飼料喂養(yǎng)4周。于第4周末大鼠禁食12 h，糖尿病組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)溶液35 mg/kg(Sigma公司，避光溶解于檸檬酸-檸檬酸納緩沖液)，正常對(duì)照組腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸納緩沖液。密切觀察72 h后，模型組繼續(xù)給予5%葡萄糖飲水、高脂飼料喂養(yǎng)2周。2周后對(duì)大鼠行口服糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，以空腹血糖≥11.1 mmol/L、餐后血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。將24只成模大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組和施今墨對(duì)藥配方低、中、高劑量組，每組各6只。

1.3 藥物干預(yù) 模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予純凈水1.5 mL/100 g灌胃，施今墨對(duì)藥配方高、中、低劑量組分別給予折合生藥含量為23.2、11.6、5.8 g/kg的施今墨對(duì)藥配方混懸液灌胃，1次/d，大鼠每周稱體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥量，連續(xù)8周。

1.4 標(biāo)本采集 給藥8周后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血6～8 mL，3 000 r/min離心15 min，取血清，-80 ℃保存用于胰島素、C肽等指標(biāo)檢測(cè)?？焖偌羧⌒迈r右葉部分肝組織，生理鹽水漂洗，濾紙吸干用于肝糖原含量檢測(cè)；剩余肝組織放入液氮冷凍，-80 ℃保存用于相關(guān)蛋白含量檢測(cè)。

1.5 胰島素抵抗指數(shù)(IRI)檢測(cè) 取動(dòng)脈血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)空腹血糖(FBG)，使用ELISA試劑盒檢測(cè)空腹C肽含量。IRI的計(jì)算采用HOMA-IR公式，IRI=(1.5+空腹血糖×空腹C肽)/2 800。

1.6 肝糖原含量檢測(cè) 取肝組織75 mg，按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入氫氧化鉀堿液25 μL，沸水浴水解20 min，冷卻至室溫。加入蒸餾水7.2 mL，加入顯色液混勻，沸水煮5 min，冷卻至室溫。上酶標(biāo)儀，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，肝糖原含量根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的公式，利用標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管的吸光度值計(jì)算糖原含量。

1.7 肝組織PI3K、AKT、GSK-3β蛋白及其磷酸化水平檢測(cè) 采用Western blotting法。取肝組織100 mg，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。采用BCA法測(cè)定組織蛋白濃度。制備10%分離膠和5%濃縮膠。上樣總蛋白100 μg，加入電泳緩沖液，設(shè)定電泳電壓及時(shí)間(濃縮膠：80 V，40 min；分離膠：150 V，1 h)。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h。加入相應(yīng)一抗(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、GAPDH，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗體(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，室溫2 h。再次洗膜后，ECL顯色，暗室內(nèi)曝光。結(jié)果用Image J軟件分析，計(jì)算蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值來(lái)表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以磷酸化蛋白含量與蛋白總含量的比值表示該蛋白的磷酸化水平。

2 結(jié)果

2.1 各組空腹血糖、IRI比較 見(jiàn)表1。

表1 各組空腹血糖、IRI比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。

2.2 各組肝糖原含量比較 正常對(duì)照組，模型對(duì)照組以及施今墨對(duì)藥配方高、中、低劑量組肝糖原含量分別為(16.01±1.30)、(8.19±1.71)、(8.37±1.68)、(8.69±1.92)、(11.37±1.47)mg/g。模型對(duì)照組肝糖原含量較正常對(duì)照組降低(P<0.05)，施今墨對(duì)藥配方低劑量組肝糖原含量較模型對(duì)照組升高(P<0.05)，高、中劑量組與模型對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 各組肝臟PI3K、AKT、GSK-3β蛋白及其磷酸化表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。

表2 各組肝臟PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達(dá)及其磷酸化水平

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，T2DM屬本虛標(biāo)實(shí)之癥，根據(jù)其發(fā)病的階段不同，有“脾癉”“消渴”“消癉”等不同稱謂。T2DM初期的病機(jī)既有肺胃郁熱，又有脾腎虧虛，肺胃郁熱而納多引飲，脾腎不足，水谷運(yùn)化與氣化不及而內(nèi)生濕濁、脂膏堆積肥胖。針對(duì)該病機(jī)，王玉等[2]提出了清肺胃、補(bǔ)脾腎、化痰濁的治療原則。在該治療原則指導(dǎo)下，我們以施今墨先生“降糖對(duì)藥”為基礎(chǔ)，擬定了施今墨對(duì)藥配方。施老擅長(zhǎng)使用“對(duì)藥”，用藥注重寒熱、升降、氣血、收散等藥物的相反相成、雙向調(diào)節(jié)[3]。他提出的著名的“降糖對(duì)藥”即黃芪與山藥、蒼術(shù)與玄參，并輔以葛根與丹參。黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)，偏于補(bǔ)脾陽(yáng)，山藥補(bǔ)脾養(yǎng)肺，養(yǎng)陰生津，補(bǔ)腎固精，側(cè)重補(bǔ)脾陰，二藥配伍陰陽(yáng)相合，健脾胃、促運(yùn)化，斂腎精、止漏濁，以防止飲食精微漏泄；蒼術(shù)善于化濁避穢，確有斂脾精、止漏濁之功，玄參質(zhì)潤(rùn)多液，清熱滋陰，瀉火解毒，二藥伍用一潤(rùn)一燥，相互制約、相互促進(jìn)得以建中宮、止漏濁、降糖甚妙[4]；葛根輕揚(yáng)升散，丹參活血祛瘀，現(xiàn)代藥理研究表明二者均具有擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)、降低血糖的作用[5，6]，二者合用側(cè)重化瘀、降低血糖之效更佳。鑒于黃芪配生地的臨床降糖效果比黃芪配山藥更好[7]，故用生地替換山藥。在上述對(duì)藥基礎(chǔ)上，加用黃連清胃燥濕、瀉火解毒，天花粉清熱瀉火、生津止渴；肉桂補(bǔ)火助陽(yáng)、引火歸源，五味子益氣生津而止渴、甘溫收澀而補(bǔ)腎陰，菟絲子補(bǔ)益肝腎，三藥合用補(bǔ)益腎氣以增氣化；桑白皮清熱瀉肺行水，厚樸燥濕消痰、行氣除滿，萊菔子消食除脹，降氣化痰。諸藥配伍，共同達(dá)到清熱潤(rùn)燥、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、扶正固本的目的。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組空腹血糖升高，IRI升高，表明T2DM大鼠體內(nèi)糖代謝發(fā)生異常，存在胰島素抵抗；經(jīng)施今墨對(duì)藥配方干預(yù)后，空腹血糖及IRI均明顯下降，表明該配方具有降低血糖、改善胰島素抵抗的效果。

肝糖原含量對(duì)于穩(wěn)定機(jī)體血糖水平非常重要。PI3K/AKT/GSK-3β是胰島素促進(jìn)葡萄糖合成肝糖原合成的重要信號(hào)通路[8]。GSK-3可抑制糖原合成酶(GS)活性，導(dǎo)致糖原合成減少，而GSK-3磷酸化會(huì)致使自身失活，進(jìn)而不可再抑制GS活性，因而更多的肝糖原會(huì)被催化合成。GSK-3β是GSK-3的重要亞基，GSK-3β絲氨酸9位點(diǎn)的磷酸化均可抑制GSK-3的活性[9]。有研究強(qiáng)力證明GSK-3β與T2DM的病理相關(guān)，GSK-3β過(guò)表達(dá)或激活異常均可導(dǎo)致T2DM[10～12]，故GSK-3β亦成為治療糖尿病和研發(fā)降糖新藥的新視角。PI3K、AKT為GSK-3β上游主要的因子之一。當(dāng)PI3K磷酸化活性增強(qiáng)，進(jìn)一步激活其下游的AKT，AKT激活后可直接磷酸化GSK-3β絲氨酸位點(diǎn)，使其失活[13，14]。研究表明糖尿病大鼠肝臟AKT磷酸化程度減弱可造成糖異生過(guò)程增強(qiáng)，從而導(dǎo)致高血糖[15]；PI3K/AKT活化降低可導(dǎo)致糖尿病大鼠肝糖原含量急劇下降[16]。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠肝糖原含量下降，經(jīng)施今墨對(duì)藥配方干預(yù)后可顯著增加肝臟組織內(nèi)糖原含量，表明施今墨對(duì)藥配方可通過(guò)增加肝臟糖原含量降低血糖。模型對(duì)照組肝臟組織PI3K蛋白含量降低、AKT蛋白含量及其磷酸活化水平均降低，GSK-3β蛋白含量增加且其磷酸失活水平下降等異常，提示T2DM大鼠肝細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/AKT/GSK-3β減弱。施今墨對(duì)藥配方低劑量干預(yù)可增加糖尿病大鼠肝臟組織PI3K蛋白表達(dá)、增加AKT蛋白表達(dá)及其磷酸活化水平，降低GSK-3β蛋白表達(dá)并增強(qiáng)其磷酸失活水平，表明施今墨對(duì)藥配方可增強(qiáng)T2DM大鼠肝臟組織PI3K-AKT-GSK-3β信號(hào)通路。

綜上所述，施今墨對(duì)藥配方具有降低血糖、減輕胰島素抵抗程度、增加肝糖原含量的作用，其機(jī)制與增強(qiáng)肝臟組織PI3K-AKT-GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。值得注意的是，施今墨對(duì)藥配方中、高劑量在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并未有明顯治療作用，推測(cè)可能與該方中、高劑量組中黃連用量較大，黃連大苦大寒，大劑量連續(xù)服用損傷脾胃反而加重T2DM脾氣虛弱的病機(jī)有關(guān)。