人參對IEC-6 細(xì)胞遷移多胺信號通路鈣離子調(diào)控影響的研究

李婧睿，張子微，袁雨晴，陳勇廷，姜欣，石杰（通訊作者）

（1. 牡丹江醫(yī)學(xué)院 第一臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

腸上皮細(xì)胞（IEC-6）是具有極性的柱狀上皮細(xì)胞，參與腸道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等，黏膜上皮內(nèi)含有大量的免疫細(xì)胞和免疫分子，是機體內(nèi)最大的免疫組織。IEC-6 是體內(nèi)更新最快的一類細(xì)胞，對維持腸上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成為研究細(xì)胞增殖和分化調(diào)控機制、營養(yǎng)素對腸上皮的作用、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腸道免疫等提供了理想的體外模型。人參在遠(yuǎn)東地區(qū)是一種很有價值的草本植物，在過去的十年里在西方廣受歡迎。關(guān)于人參及其成分的有益作用已有大量文獻(xiàn)。人參的主要活性成分是人參皂苷，這是一組不同種類的甾體皂苷，具有靶向多種組織、產(chǎn)生一系列藥理反應(yīng)的能力。然而，人參皂苷活性的許多機制尚不清楚。由于人參皂苷和人參的其他成分產(chǎn)生的作用是不同的，并且一種人參皂苷在同一組織中引發(fā)多種作用，因此人參的整體藥理學(xué)是復(fù)雜的。人參皂苷能夠獨立地靶向細(xì)胞膜上的多受體系統(tǒng)，以及激活細(xì)胞內(nèi)類固醇受體，這可能解釋了一些藥理作用。多胺在腸上皮細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著重要作用。本次研究以IEC-6 細(xì)胞遷移模型為基礎(chǔ)，提出人參對IEC-6 細(xì)胞遷移多胺信號通路鈣離子調(diào)控影響[1]。具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗資料。選取精密稱取20g 人參藥材飲片，打粉，加入150 mL100%甲醇35℃，500 w 超聲提取30 min，雙層紗布過濾并回收濾液；殘余人參藥材粉末再加入150 mL+100%甲醇，相同條件超聲提取30 min，回收濾液；再加入100 mL+100% 甲醇，相同條件超聲提取30 min，合并3 次回收的濾液。0.22 pm 有機濾膜抽濾，得人參甲醇溶液。用手術(shù)刀劃痕法研究人參對IEC-6 細(xì)胞遷移的影響，上皮整復(fù)必須要有細(xì)胞內(nèi)多胺的參與，在模擬上皮整復(fù)的體外小腸上皮（IEC-6）細(xì)胞模型中，刺激細(xì)胞遷移也需要多胺的參與。多胺介導(dǎo)信號通路是IEC-6 細(xì)胞遷移的主要調(diào)控因素，其中鈣離子是該通路的關(guān)鍵指標(biāo)。

1.2 實驗方法。流式細(xì)胞：使用流式細(xì)胞儀-CyFlow Cube6，細(xì)胞膜電位（Em）和細(xì)胞質(zhì)游離鈣離子濃度，熒光CV＜2%，DNA 檢測CV＜1%，顆粒檢測范圍寬，0.1-100 um，銷售商：廣州吉源生物。熒光定量PCR 法：賽默飛：使用ABI 熒光定量儀（百泰克），Kvl.1、TRPC1、PLC-γ1、RhoA、Rac1、Cdc42 mRNA 表達(dá)。Western blot 法：使用Western Blot 自動分析儀（京佰樂良成科技有限公司），Kvl.l、TRPC1、PLC-γl、RhoA、Racl、Cdc42 蛋白表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡：肌球蛋白II（myosinII）蛋白的表達(dá)和分布。所有實驗操作，嚴(yán)格按照儀器說明書執(zhí)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（G±s），采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)先進行方差齊性檢驗，然后再進行單因素的方差分析，方差齊采用LSD 法進行組間比較，方差不齊時采用Dunnett’s T3 法進行組間比較。分析人參提取物對IEC-6 細(xì)胞遷移影響的量效關(guān)系[2]。

2 結(jié)果

2.1 人參多糖中的蛋白含量。由人參多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線來看，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（R2=0.99378），線性范圍在0.00567 -0.09423 mg· mL-1。人參多糖蛋白含量2.18 mg· mL-1（共740 mL），經(jīng)過sevag 方法去除蛋白后，人參中的多糖蛋白已經(jīng)被大部分去除，所剩蛋白含量非常低。蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線分布情況可見圖1 所示。

圖1 蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)值

圖2 人參多糖經(jīng)化DEAE-纖維素層析柱超純水洗脫液吸光度值

由圖2 中，能夠看到人參多糖中的纖維素層比較豐富，纖維素是白色微晶形物質(zhì)，不溶于水和有機溶劑。在酸或酶的作用下能水解，最終產(chǎn)物是葡萄糖。人的消化道中無纖維素水解酶，所以不能消化纖維素。人體不能將纖維素水解成葡萄糖，但纖維素有促進腸蠕動等作用，對人體健康有益[3]。

2.2 人參對IEC-6 細(xì)胞遷移多胺信號通路鈣離子調(diào)控影響。本次研究中對多胺信號通路鈣離子調(diào)控的相關(guān)指標(biāo)DFMO 負(fù)荷構(gòu)建了模型圖，人參多糖負(fù)荷增加[Ca2+]cyt，可導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]cyt 降低，并且存在顯著差異（P＜0.01）。由圖3和圖4 提示，人參多糖促進細(xì)胞遷移與增細(xì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt有關(guān)。具體見下圖3 與圖4 所示。

圖3 正常對照組DFMO 負(fù)荷圖

圖4 人參組DFMO 負(fù)荷圖

3 討論

人參本身具有益氣健脾的作用，而通過多糖蛋白含量的測定，能夠更好的確定水煎煮方法的多糖得率較高。另外，研究發(fā)現(xiàn)人參多糖經(jīng)化DEAE-5 方法對于人參的多糖分離純化較好，但是所提取的人參多糖仍含有雜質(zhì)，本研究使用纖維素層析柱超純水洗脫的方法能夠進一步純化人參多糖，去除雜質(zhì)，且純度更高。

人體消化性潰瘍病通常伴有胃十二指腸粘膜的彌漫性炎癥和潰瘍部位的嚴(yán)重局部炎癥。粘膜修復(fù)的質(zhì)量可能是決定潰瘍是否復(fù)發(fā)的最重要因素。粘膜結(jié)構(gòu)的正確修復(fù)需要上皮和結(jié)締組織成分的平衡刺激和相互作用，以及控制這些成分的生長因子的激活[4]。大量研究顯示，人參能夠促進胃腸粘膜損傷修復(fù)的作用機制，而本次研究中通過科學(xué)的方法，明確人參對IEC-6 細(xì)胞遷移多胺信號通路鈣離子調(diào)控影響的相關(guān)指標(biāo)DFMO 負(fù)荷構(gòu)建了模型圖，人參多糖負(fù)荷增加[Ca2+]cyt，可導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]cyt 降低，并且存在顯著差異（P＜0.01）。由圖3 和圖4 提示，人參多糖促進細(xì)胞遷移與增細(xì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]cyt 有關(guān)。[Ca2+]cyt 主要來源于人體細(xì)胞內(nèi)的鈣儲存庫釋放，以及細(xì)胞外[Ca2+]cyt 的內(nèi)流，人參多糖能夠增加IEC-6 細(xì)胞遷移過程的[Ca2+]cyt 可逆轉(zhuǎn)因DFMO 負(fù)荷所致的[Ca2+]cyt 減少。在IEC-6 細(xì)胞內(nèi)增加多胺，可激活鉀通道，膜電位超極化也因此被增加，從而更好的提高[Ca2+]內(nèi)流驅(qū)動力，進而達(dá)到增加[Ca2+]cyt 的作用。因此，人參多糖能夠作為調(diào)控多胺信號通路鈣離子的作用機制之一[5]。

綜上所述，人參作為益氣健脾中藥內(nèi)含的多糖能夠有效調(diào)控IEC-6 細(xì)胞遷移多胺信號通路鈣離子，對藥物的作用靶點明確，能夠為臨床尋找新的治療上皮表面損傷為特征的胃腸道病藥物，提供一定的理論基礎(chǔ)。