梔子葉片愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化研究

田亞 徐志超 胡開(kāi)治

摘要 目的：對(duì)梔子（Gardenia jasminoides Ellis）葉片愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行優(yōu)化研究。方法：通過(guò)以葉片為外植體，MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同激素組合（6-BA、NAA和IBA）進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究。結(jié)果：梔子葉片在WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L以及6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1（或0.5）mg/L中均有100%的誘導(dǎo)率;在MS培養(yǎng)基上，MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L的誘導(dǎo)率最好，分別為70%和74%。梔子葉片愈傷組織在再分化培養(yǎng)基上均未誘導(dǎo)出叢生芽。結(jié)論：WPM培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更易誘導(dǎo)梔子葉片愈傷組織，且梔子愈傷組織的再分化較困難。

關(guān)鍵詞 梔子;葉片;愈傷組織誘導(dǎo);MS培養(yǎng)基;WPM培養(yǎng)基;6-BA;NAA;IBA

Abstract Objective：To study the optimization of leaf callus induction in Gardenia jasminoides Ellis.Methods：The callus induction was studied using leaves as explant，MS and WPM as basic medium adding different hormone combinations（6-BA，NAA and IBA）.Results：Gardenia leaves had a 100% of callus induction rate in WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L or 6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1（or 0.5）mg/L，while 70% and 74% were the best induction rates in MS+6-BA 1.0（or 1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L，respectively.The leaf callus of Gardenia did not induce cluster buds in the redifferentiation medium.Conclusion：Compared with MS medium，the callus was easy to be induced in WPM medium，and the redifferentiation of Gardenia callus was difficult.

Keywords Gardenia jasminoides Ellis; leaves; Callus induction; MS medium; WPM medium; 6-BA; NAA; IBA

梔子（Gardenia jasminoides Ellis），為茜草科梔子屬多年生常綠灌木，生于丘陵山谷或山坡灌叢中，分布于江蘇、安徽、浙江、江西、福建和貴州等地[1]。其干燥成熟果實(shí)是傳統(tǒng)中藥，屬原衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，性味苦寒，有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等功效，主要活性物質(zhì)有環(huán)烯醚萜類(lèi)（梔子苷）、二萜色素類(lèi)（西紅花苷和西紅花酸）、有機(jī)酸類(lèi)（綠原酸和熊果酸）和油脂類(lèi)等[2]。其中，從梔子成熟果實(shí)提取的黃色素著色力強(qiáng)、安全性高、成本較低，且有一定的保健和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域，是國(guó)際上允許生產(chǎn)和使用的天然食用黃色素[3-4]。此外，梔子花朵美麗、花香沁人心脾，是園林塑景以及發(fā)展休閑和觀光農(nóng)業(yè)的優(yōu)勢(shì)物種[5]。梔子集藥用、食用及觀賞價(jià)值于一體，應(yīng)用前景十分廣闊。建立梔子組培體系，對(duì)梔子優(yōu)良品種選育及保存具有重要意義。

在麻瘋樹(shù)的組織培養(yǎng)研究中，趙雪惠等[6]以幼胚為外植體，去除胚乳，接種于4種（MS、LM、WPM和N6）未添加任何植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在MS與WPM培養(yǎng)基上能夠大量誘導(dǎo)出愈傷組織，并且WPM培養(yǎng)基上分化出不定芽數(shù)量最多。以WPM為基本培養(yǎng)基，添加激素組合6-BA與NAA如懸鈴木[7]和青錢(qián)柳[8]，或添加激素組合6-BA與IBA如大果櫸[9]和胡楊[10]，均可誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽，最后得到再生植株。在梔子的組織培養(yǎng)研究中，多以MS為基本培養(yǎng)基，篩選梔子組織培養(yǎng)最適激素配比[11-12]，未見(jiàn)采用WPM培養(yǎng)基的研究。因此，本研究擬以MS及木本植物培養(yǎng)基WPM為基本培養(yǎng)基，添加激素6-BA、NAA和IBA，對(duì)梔子葉片愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織再分化進(jìn)行研究，進(jìn)一步完善梔子組織培養(yǎng)體系，為梔子優(yōu)良品種選育和保存、梔子功能基因組研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

梔子取自重慶市藥物種植研究所培育的優(yōu)良品種ZZ1-9的扦插盆栽苗。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，無(wú)黃葉無(wú)病態(tài)的梔子幼嫩莖尖為材料。

所需植物激素為6-芐氨基嘌呤（6-BA，華綠源科技有限公司，北京），萘乙酸（NAA，華綠源科技有限公司，北京），吲哚丁酸（IBA，華綠源科技有限公司，北京），所需基本培養(yǎng)基為MS（Murashige & Skoog with Vitamins，Caisson labs，美國(guó)，批號(hào)：0619003）和WPM（McCown Woody Plant medium with vitamins，COOLABER，中國(guó)，批號(hào)：PM28151421）培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 獲取無(wú)菌外植體 選取梔子幼嫩莖尖2～3 cm為外植體，自來(lái)水沖洗干凈后在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行后續(xù)滅菌操作。先用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水洗3次，再用2%次氯酸鈉消毒10～15 min，無(wú)菌水洗5～6次。將消過(guò)毒的外植體放在無(wú)菌濾紙上吸干表面水分，接種到不添加激素的MS培養(yǎng)基上啟動(dòng)培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)入無(wú)菌苗培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，無(wú)菌苗培養(yǎng)基[13]為MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH=5.8。

2.2 葉片愈傷組織誘導(dǎo) 將梔子無(wú)菌苗葉片剪掉邊緣后剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，使用無(wú)菌鑷子接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA和NAA的激素組合（見(jiàn)表1中YA1-10）。培養(yǎng)30 d后記錄梔子葉片在不同激素組合以及在MS和WPM 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)情況。愈傷組織誘導(dǎo)率=（長(zhǎng)出愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%。

2.3 愈傷組織再分化的誘導(dǎo) 將MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的綠色愈傷組織切分成0.5 cm×0.5 cm的小塊，分別接種于愈傷組織再分化培養(yǎng)基上，以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA和IBA的激素組合（見(jiàn)表1中YB1-10）。培養(yǎng)30 d后記錄梔子葉片在不同激素組合以及在MS和WPM 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織再分化情況。愈傷組織再分化率=（再分化的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)）×100%。

3 結(jié)果

3.1 MS培養(yǎng)基附加不同激素組合對(duì)梔子葉片愈傷組織形成的影響 MS培養(yǎng)基上添加激素6-BA和NAA不同配比對(duì)梔子葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況如圖1所示。MS培養(yǎng)基若不添加任何激素則無(wú)愈傷組織產(chǎn)生。添加不同激素配比的培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)愈傷組織，但愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷組織狀態(tài)有較大差異。在愈傷組織誘導(dǎo)率方面，YA10、YA7的愈傷組織誘導(dǎo)率較高，分別為74.7%、70.7%。從愈傷組織生長(zhǎng)情況來(lái)看，在YA4中多為白色，其余處理中多為綠色致密。在YA2和YA3中的愈傷組織，到后期愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，在YA4、YA7和YA10中愈傷組織生長(zhǎng)較快。綜合考慮愈傷組織誘導(dǎo)率及愈傷組織生長(zhǎng)情況，梔子葉片適宜的MS愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為YA7和YA10，即為MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH=5.8。

3.2 WPM培養(yǎng)基附加不同激素組合對(duì)梔子葉片愈傷組織形成的影響 WPM培養(yǎng)基添加激素6-BA和NAA不同配比對(duì)梔子葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況如圖2所示。WPM培養(yǎng)基若不添加任何激素，和MS培養(yǎng)基一樣，均無(wú)愈傷組織產(chǎn)生。WPM培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于MS培養(yǎng)基，YA4、5和7的愈傷組織誘導(dǎo)率均達(dá)到100%，且在添加激素的處理中誘導(dǎo)率均超過(guò)80%。其中，YA2、5和8整體為綠色、較小愈傷組織;YA4、7和10多是在愈傷組織底部為綠色致密、邊緣為白色疏松，且大部分愈傷組織生長(zhǎng)較快。

3.3 MS培養(yǎng)基附加不同激素組合對(duì)愈傷組織再分化的影響 MS培養(yǎng)基添加激素6-BA和IBA不同配比對(duì)梔子葉片愈傷組織再分化情況見(jiàn)圖3（A）所示。葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在添加激素6-BA和IBA不同配比的MS培養(yǎng)基上均未誘導(dǎo)出叢生芽。

3.4 WPM培養(yǎng)基附加不同激素組合對(duì)愈傷組織再分化的影響 WPM培養(yǎng)基添加激素6-BA和IBA不同配比對(duì)梔子葉片愈傷組織再分化情況見(jiàn)圖3（B）所示。葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在添加激素6-BA和IBA不同配比的WPM培養(yǎng)基上均未誘導(dǎo)出叢生芽。

4 討論

WPM是木本植物組織培養(yǎng)優(yōu)選培養(yǎng)基，多種木本植物以WPM為基本培養(yǎng)基建立再生體系，如喜樹(shù)[14]，中國(guó)李[15]、茶條槭[16]等。然而，梔子組培體系研究多以MS為基本培養(yǎng)基，還未見(jiàn)以WPM為基本培養(yǎng)基的研究。本研究以梔子葉片為外植體，MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同激素組合的6-BA和NAA或IBA，進(jìn)行葉片愈傷組織誘導(dǎo)及愈傷組織再分化研究，對(duì)梔子葉片愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行優(yōu)化。梔子葉片在MS和WPM培養(yǎng)基不添加任何激素的情況下，均無(wú)愈傷組織產(chǎn)生，而在添加不同激素配比的培養(yǎng)基上，雖然誘導(dǎo)率以及愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)有所差異，但均有愈傷組織產(chǎn)生，表明植物激素在愈傷組織的誘導(dǎo)中起著重要作用。梔子葉片在WPM培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于MS培養(yǎng)基，在添加不同激素配比的WPM培養(yǎng)基上均超過(guò)80%，而在MS培養(yǎng)基上，愈傷組織的最高平均誘導(dǎo)率為74.7%。但在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織多為綠色致密，在WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織多為白色疏松。以MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的綠色愈傷組織為材料，接種于添加6-BA和IBA不同激素組合的MS和WPM的再分化培養(yǎng)基上，均無(wú)愈傷組織再分化。

本研究以固體MS及WPM為基本培養(yǎng)基，梔子葉片誘導(dǎo)愈傷組織材料，添加6-BA及IBA并未誘導(dǎo)出叢生芽。而張慶紅等[17]研究表明用梔子種子愈傷組織可通過(guò)MS液體培養(yǎng)分化出芽，添加的激素TDZ是一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，已成功地用于多種植物不定芽的誘導(dǎo)，對(duì)于木本植物的不定芽誘導(dǎo)具有突出的效果[18]。因此，可進(jìn)一步采用MS或WPM培養(yǎng)基上添加TDZ，以液體培養(yǎng)方式對(duì)梔子葉片愈傷組織進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

梔子所含西紅花苷及西紅花酸，是色素類(lèi)物質(zhì)，不僅可食用，亦是被譽(yù)為“紅色黃金”的名貴中藥材西紅花的主要活性物質(zhì)。西紅花入藥部位為柱頭，一朵西紅花僅有3個(gè)柱頭，柱頭產(chǎn)量低，且人工采收成本高，加上西紅花主產(chǎn)地在伊朗、希臘等國(guó)家，在我國(guó)資源短缺，導(dǎo)致西紅花價(jià)格昂貴[19]。而梔子栽培地廣，果實(shí)產(chǎn)量高，更適宜用來(lái)研究西紅花苷等活性物質(zhì)。所以，優(yōu)化梔子組培體系，可為建立梔子功能基因研究體系提供理論依據(jù)，對(duì)梔子所含活性物質(zhì)作用機(jī)制研究、梔子優(yōu)良品種選育及保存具有重要意義。

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（2020-02-10收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）