添加Fe2+對克雷伯氏菌發(fā)酵產(chǎn)氫特性的影響

丁鵬飛，李艷賓，蔣卉，張琴

(1.安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

近年來，采用木質(zhì)纖維素開發(fā)清潔能源已受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注[1-2]。氫能的開發(fā)已成為各國競爭的焦點[3-4]。木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)氫已有一定研究[5-6]，然其產(chǎn)氫量仍有待提高。氫酶在調(diào)控細菌產(chǎn)氫中起重要的催化作用[7-8]，其活性中心可與Fe、Ni金屬元素結(jié)合[9]。Fe可作為氫酶的激活劑[10]，還是氫酶電子載體——鐵氧還蛋白活性中心的組成成分[11]，可通過影響氫酶的活性改善微生物產(chǎn)氫性能[12]，從而提高生物氫產(chǎn)量[13]。

本研究通過檢測不同濃度Fe2+對克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程的影響，闡明Fe2+添加對菌株發(fā)酵產(chǎn)氫的調(diào)控作用，對棉稈水解糖液產(chǎn)氫的高效調(diào)控具有重要指導(dǎo)意義。

1 實驗部分

1.1 菌種和棉稈原料

發(fā)酵菌種克雷伯氏菌(Klebsiellasp.WL1316)為一株分離自塔里木河流域野生鯉魚腸道的產(chǎn)氫細菌[14]，其活化、種子、發(fā)酵相關(guān)的培養(yǎng)基參考文獻[14-15]，發(fā)酵培養(yǎng)基中通過添加FeSO4提供Fe2+來源，將Fe2+質(zhì)量濃度換算為0，10，20，30，40，50 mg/L添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個重復(fù)處理3次；棉稈原料采自新疆阿拉爾棉田。

1.2 棉稈水解糖液的制備

棉稈水解糖液制備方法參照Zhang等報道的棉稈酸解優(yōu)化工藝[16]進行，獲得的糖液經(jīng)脫毒、脫色后再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至所需糖濃度備用。

1.3 菌種的活化、接種與發(fā)酵產(chǎn)氫

參考文獻[15]的方法，菌種活化并制備種子液，進一步接種發(fā)酵培養(yǎng)基，于生化培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。每24 h收集氫氣并取發(fā)酵液，檢測菌體OD600，并測定上清液中的葡萄糖和木糖濃度。發(fā)酵周期為120 h，在各發(fā)酵時間點將相應(yīng)發(fā)酵時間段的產(chǎn)氫量累加換算為累積產(chǎn)氫量∑Vt。

1.4 分析檢測和計算方法

葡萄糖或木糖濃度分別采用DNS[17]、地衣酚比色法[18]測定。葡萄糖(或木糖)利用率表示為發(fā)酵過程中利用的葡萄糖(或木糖)濃度占初始葡萄糖(或木糖)濃度的百分比?；谶€原糖利用的產(chǎn)氫效率Y(H2/S)表示為H2產(chǎn)生終濃度與利用的還原糖濃度的比值，基于還原糖利用的菌體生長效率Y(OD600/S)表示為菌體生長的OD600變化值與利用的還原糖濃度的比值。

不同F(xiàn)e2+添加濃度下的累積產(chǎn)氫量采用改進的Gompertz方程進行動力學(xué)擬合[19]，方程如下：

其中，H代表累積產(chǎn)氫量(mL/L),P代表產(chǎn)氫潛力(mL/L),Rm代表最大產(chǎn)氫速率[mL/(L·h)],λ代表延滯期時間(h)，e=2.718 28；采用Sigmaplot 12.0軟件對動力學(xué)參數(shù)P、Rm和λ值進行計算和分析，并獲得相關(guān)系數(shù)R2。采用Origin 8.0軟件對各處理數(shù)據(jù)進行計算、分析及作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe2+添加對克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液產(chǎn)氫過程的影響

本研究采用的Klebsiellasp.WL1316是一株具有Ni-Fe氫酶的產(chǎn)氫細菌[20]，因此，在發(fā)酵產(chǎn)氫體系中添加一定濃度Fe2+可能提高氫酶活性，從而促使菌株合成生物氫。對該菌株發(fā)酵120 h內(nèi)的產(chǎn)氫量進行了監(jiān)測，換算為累積產(chǎn)氫量，結(jié)果見圖1。

圖1 不同F(xiàn)e2+添加濃度下的累積產(chǎn)氫量隨時間的變化

由圖1可知，在較低Fe2+濃度添加范圍內(nèi)(10～20 mg/L)，菌株發(fā)酵120 h 的累積產(chǎn)氫量高于對照處理(0 mg/L)的，尤以Fe2+添加濃度為20 mg/L的累積產(chǎn)氫量最高，達2 200 mL/L以上，較之0 mg/L處理的提高約20%，可見，添加該濃度Fe2+的處理能有效促進菌株合成生物氫。當(dāng)Fe2+添加濃度提高至30 mg/L及以上，累積產(chǎn)氫量則降低，低于0 mg/L處理的，并且Fe2+添加濃度越高，累積產(chǎn)氫量越低。由此說明，當(dāng)Fe2+添加濃度高于一定值時，則可能抑制菌株生物氫的合成。本研究獲得的Fe2+添加對棉稈水解糖液暗發(fā)酵產(chǎn)氫的作用規(guī)律與一些文獻報道中采用葡萄糖作為發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)氫的作用規(guī)律類似[21-23]，即在一定添加濃度范圍內(nèi)，適當(dāng)濃度的Fe2+能促進生物氫的合成，由此看來，F(xiàn)e2+添加至不同的發(fā)酵產(chǎn)氫體系對生物氫合成的作用效果可能一致。

表1為Gompertz方程擬合結(jié)果。

表1 不同F(xiàn)e2+添加濃度下Gompertz方程擬合累積產(chǎn)氫量的參數(shù)和相關(guān)系數(shù)Table 1 The Gompertz equation fitted parameters and correlation coefficients of cumulative hydrogen production at different Fe2+ addition concentrations

由表1可知，模型的相關(guān)系數(shù)R2均達0.98以上，表明Gompertz方程能夠較好地對各Fe2+濃度處理的累積產(chǎn)氫量進行擬合。Fe2+添加濃度為10 mg/L和20 mg/L處理的動力學(xué)參數(shù)P、Rm值均高于0 mg/L處理的，說明添加10～20 mg/L的Fe2+能較大程度地提高菌株的產(chǎn)氫潛力。從延滯期λ值來看，10 mg/L處理的λ值略低于0 mg/L處理的，表明低濃度Fe2+可能使延滯期縮短，從而促進菌株產(chǎn)氫。隨著添加濃度的增加，延滯期有可能延長以增強自身對增加的Fe2+的適應(yīng)能力，當(dāng)然，λ值適當(dāng)?shù)匮娱L，菌株仍可保持較高的產(chǎn)氫潛力，如Fe2+添加濃度為20 mg/L的處理，其λ值較之0 mg/L處理的高，但仍獲得了最高的P、Rm值，分別達2 550.63 mL/L，25.08 mL/(L·h)。這些產(chǎn)氫動力學(xué)表現(xiàn)與Taherdanak等的報道[23-24]一致。

2.2 Fe2+添加對棉稈水解糖液中還原糖利用和菌體生長的影響

以棉稈水解糖液的還原糖組分主要為葡萄糖和木糖[14,16]，因此，本研究對發(fā)酵過程的葡萄糖和木糖濃度進行監(jiān)測，同時動態(tài)監(jiān)測克雷伯氏菌的生長OD600值，并換算為葡萄糖、木糖利用率和OD600增長值ΔOD600，結(jié)果見圖2。

圖2 不同F(xiàn)e2+添加濃度下的葡萄糖、木糖利用率和ΔOD600值

由圖2可知，當(dāng)Fe2+添加濃度為10，20 mg/L時，葡萄糖、木糖利用率和ΔOD600值均高于濃度0 mg/L處理的，尤以20 mg/L處理獲得的葡萄糖、木糖利用率和ΔOD600值最高，較之0 mg/L處理的分別提高12%，4.3%和6.5%?？梢?，該添加濃度有利于發(fā)酵基質(zhì)中還原糖的利用及菌體的生長。隨著Fe2+添加濃度的進一步提高，葡萄糖、木糖利用率和ΔOD600值低于濃度0 mg/L處理的，且濃度越高其值越低。由于棉稈水解糖液是主要由葡萄糖和木糖組成的混合糖液，其為克雷伯氏菌利用的規(guī)律與一些以葡萄糖為簡單碳源的利用規(guī)律不同：以葡萄糖為碳源的基質(zhì)利用率在添加不同濃度Fe2+處理中的差異較小，差異值在5%以內(nèi)[23-25]。

2.3 Fe2+添加對克雷伯氏菌基于還原糖利用的產(chǎn)氫效率和菌體生長效率的影響

對不同F(xiàn)e2+添加濃度下的基于還原糖利用的產(chǎn)氫效率Y(H2/S)和菌體生長效率Y(OD600/S)進行了換算，結(jié)果見圖3。

圖3 不同F(xiàn)e2+添加濃度下的基于還原糖利用的產(chǎn)氫效率和菌體生長效率

由圖3可知，F(xiàn)e2+添加濃度為10，20 mg/L處理的Y(H2/S)明顯高于0 mg/L處理的，其值分別提高8.3%，7.9%。30，40 mg/L處理的Y(H2/S)與0 mg/L處理的較接近，而50 mg/L處理的明顯降低。由此可認(rèn)為，較低Fe2+添加濃度(10～20 mg/L)在促使克雷伯氏菌保持較高產(chǎn)氫量和還原糖利用率前提下，仍可使其有較高的從還原糖基質(zhì)合成氫氣的轉(zhuǎn)化效率，彰顯出該濃度范圍較有效地促進產(chǎn)氫的作用。從菌體生長效率Y(OD600/S)來看，其值在低Fe2+添加濃度(10～20 mg/L)范圍與0 mg/L處理的接近，而在相對較高濃度處理下則有所降低。可見，盡管克雷伯氏菌在低Fe2+添加濃度范圍有較高的ΔOD600值和還原糖利用率，其由還原糖基質(zhì)用于菌體生長的轉(zhuǎn)化效率實則不夠，但其值與0 mg/L處理的接近亦可說明添加Fe2+后，產(chǎn)氫體系仍可保持一定的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

較低Fe2+添加濃度(10～20 mg/L)可促進克雷伯氏菌發(fā)酵棉稈水解糖液合成生物氫，尤以Fe2+添加濃度為20 mg/L的累積產(chǎn)氫量最高，達2 200 mL/L以上，較之未添加Fe2+處理的提高約20%，而相對較高濃度Fe2+添加則造成累積產(chǎn)氫量降低，對菌株生物氫的合成產(chǎn)生抑制作用。基于Gompertz模型對添加不同F(xiàn)e2+濃度下的累積產(chǎn)氫量進行的動力學(xué)擬合驗證了Fe2+添加對菌株產(chǎn)氫的作用效果，仍以添加20 mg/L Fe2+能最大程度地提高菌株的產(chǎn)氫能力，該濃度處理下的P、Rm值分別可達2 550.63 mL/L，25.08 mL/(L·h)。

Fe2+添加濃度為20 mg/L的處理，菌株獲得的葡萄糖、木糖利用率和ΔOD600值最高，較之未添加Fe2+處理的分別提高12%，4.3%和6.5%，表明該添加濃度不僅能有效促進菌株生物氫的合成，亦有利于發(fā)酵基質(zhì)中還原糖的利用和菌體的生長。不同濃度Fe2+添加處理的葡萄糖和木糖利用率差異較大，這與一些以葡萄糖為簡單碳源的利用規(guī)律不同，彰顯出以棉稈水解糖液這種混合糖液為產(chǎn)氫細菌利用中的獨特性。在此基礎(chǔ)上進行的基于還原糖利用的產(chǎn)氫效率Y(H2/S)證實較低Fe2+添加濃度(10～20 mg/L)在促使克雷伯氏菌保持較高產(chǎn)氫量和還原糖利用率前提下，仍可使其有較高的從還原糖基質(zhì)合成氫氣的轉(zhuǎn)化效率，而基于還原糖利用的菌體生長效率Y(OD600/S)在低Fe2+添加濃度(10～20 mg/L)范圍與未添加Fe2+處理的接近，表明其值雖無明顯提高，但仍可使產(chǎn)氫體系保持一定的穩(wěn)定性。