基于高通量測序技術(shù)的藏系綿羊瘤胃與糞便微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

王循剛，徐田偉，劉宏金，胡林勇，張曉玲，耿遠月，趙 娜，徐世曉

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

反芻動物的消化道尤其是瘤胃中棲息著豐富的微生物，包括纖維素降解菌、淀粉降解菌等細菌，產(chǎn)甲烷菌等古菌，以及大量的原蟲和真菌等[1-3]。這些微生物通過相互作用，共同保持瘤胃內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，在宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、能量代謝和生理健康等方面起重要作用[4-6]。作為反芻動物消化道中重要的發(fā)酵器官，瘤胃在大量微生物的協(xié)同作用下，可以高效率地對宿主所攝入的營養(yǎng)物質(zhì)進行降解，產(chǎn)生大量能源物質(zhì)對機體的生命活動進行供能[7-8]。研究報道，隨著宿主的種類、年齡、飼糧組成、飼養(yǎng)方式等的改變，瘤胃中微生物的組成和豐度也會發(fā)生相應(yīng)變化[9-12]。除了瘤胃，反芻動物的腸道微生物群落同樣值得關(guān)注，尤其是糞便微生物，往往認為與宿主的營養(yǎng)和健康密切相關(guān)[13]。許強等[14]通過限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(Restricted fragment length polymorphisms，RFLP)分別分析了腹瀉和健康狀態(tài)下荷斯坦?fàn)倥Ｖ蹦c糞便中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)直腸形成了獨特且復(fù)雜多樣的微生物群落環(huán)境，且腹瀉時其中的腸球菌屬、乳桿菌屬等顯著增加。Li等[15]通過對不同程度腹瀉林麝的糞便微生物進行檢測，發(fā)現(xiàn)與健康狀態(tài)下的微生物區(qū)系存在顯著差異。現(xiàn)有研究認為，對糞便樣品化學(xué)成分的測定，有助于了解宿主對所攝入營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化情況[16-17]，而對其中微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，則可以了解宿主的生理健康狀況。藏系綿羊(Ovisaries)作為青藏高原地區(qū)特有的綿羊品種，長期生活在海拔3 000 m以上，對青藏高原嚴酷的高寒環(huán)境具有很強的適應(yīng)性，是藏區(qū)牧民重要的生產(chǎn)和生活資料[18]。瘤胃和直腸糞便這兩大微生物區(qū)系特征以及兩者之間的群落結(jié)構(gòu)差異研究對于了解藏系綿羊獨特的高原適應(yīng)性具有重要意義。目前，關(guān)于藏系綿羊消化道微生物的研究僅圍繞瘤胃開展[19-20]，而對直腸糞便微生物的研究鮮有報道。因此，本研究以16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)作為分子標(biāo)記，利用IlluminaHiSeq 2500測序平臺分別對藏系綿羊瘤胃和直腸糞便的微生物群落進行高通量測序，探究藏系綿羊瘤胃和直腸糞便微生物菌群的結(jié)構(gòu)和組成，并對兩者之間的群落結(jié)構(gòu)差異進行分析，旨在為藏系綿羊的健康養(yǎng)殖、疫病防疫及相關(guān)營養(yǎng)學(xué)研究提供一定的數(shù)據(jù)積累。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

2016年4月至7月在青海省海北高原現(xiàn)代生態(tài)畜牧業(yè)科技示范園放牧樣地對藏系綿羊進行天然放牧，牧草中含粗蛋白質(zhì)11.45%、粗脂肪 1.53%、中性洗滌纖維50.43%、酸性洗滌纖維 31.57%，地上生物量為103.71 g/m2。于7月挑選5只平均月齡為6月齡，平均體質(zhì)量為 (21.50±0.59)kg的天然放牧藏系公綿羊進行樣品 采集。

1.2 樣品的采集與處理

分別采集每只綿羊的瘤胃液和糞便樣品，每組樣品5個重復(fù)。采集瘤胃液時，打開羊的口腔，使用瘤胃插管法將瘤胃管從羊口腔緩慢插入，抽取瘤胃內(nèi)容物約50 mL，然后用4層紗布過濾，收集濾液；糞便采集時，于直腸處采集新鮮糞便約 5 g，裝入凍存管，編號后立即投入液氮中保存。所有樣品帶回實驗室，于-80 ℃保存，待測。

1.3 DNA提取及高通量測序

取200 mg瘤胃液或糞便樣品，使用TIANGEN DNA提取試劑盒提取樣品的總DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。以樣品提取的總DNA為模板對細菌16S rRNA的V3～V4區(qū)域進行PCR擴增，擴增引物為：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[21]，反應(yīng)體系為25 μL：Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL，5×Reaction Buffer 5 μL，5×High GC Buffer 5 μL，dNTP(1×104μmol/L)0.5 μL，模板DNA 1 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，H2O 11.25 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為：98 ℃預(yù)變性2 min；循環(huán)30次(98 ℃30 s； 50 ℃ 30 s；72 ℃1 min)；72 ℃延伸5 min，4 ℃冷卻，PCR擴增產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。通過IlluminaHiSeq 2500測序平臺對DNA片段進行高通量測序，獲得原始數(shù)據(jù)后再進行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.4 微生物多樣性的生物信息學(xué)分析

使用FLASH[22]和QIIME[23]對原始數(shù)據(jù)進行拼接過濾，得到優(yōu)化序列，根據(jù)相似度為97%的原則對序列進行操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類，并挑選出相對豐度最高的序列作為每個OTU的代表性序列。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/)對每條代表性序列進行物種注釋并構(gòu)建OTU分類信息表，繪制在門水平和屬水平上的物種分布柱狀圖。計算每個試驗樣本的α多樣性和β多樣性。α多樣性由反映群落豐富度的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)及反映群落多樣性的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)進行評估。β多樣性選擇利用加權(quán)遺傳距離矩陣(Weighted uniFracdistance)計算，并進行PCoA分析。使用PICRUSt[24]進行KEGG微生物基因功能預(yù)測分析。數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準差”的形式表示，組間差異利用SPSS 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 各樣品測序結(jié)果

經(jīng)測序，藏系綿羊瘤胃液和糞便10個樣品共獲得729 326條原始序列(Raw tags)，原始序列經(jīng)過濾后獲得優(yōu)化序列(Clean tags)651 449條，平均每個樣品含有(65 145±320)條，每條序列平均長度為(435.20±2.78)bp。樣品的稀釋曲線趨于平緩(圖1-A)，說明本試驗測序所得數(shù)據(jù)量已經(jīng)覆蓋樣本中的絕大多數(shù)物種?；谙嗨贫却笥?7%的原則，將測序所得有效序列進行OTU聚類，共得到1 207個OTU(圖1-B)，其中瘤胃中獨有的有479個，糞便中獨有的有309個，兩組間共享的OTU有419個。

2.2 微生物群落多樣性分析

2.2.1 α多樣性分析 為了研究藏系綿羊瘤胃和糞便微生物群落的豐富度和多樣性，對兩組的α多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計計算和差異顯著性檢驗，結(jié)果如表1所示。瘤胃微生物的Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于糞便微生物(P<0.05)；而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在兩組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表1 瘤胃和糞便微生物群落α多樣性分析Table 1 α diversity analysis between rumen and feces

2.2.2 β多樣性分析 為了探究藏系綿羊瘤胃和糞便微生物群落組成的差異性，基于樣本的OTU信息，計算樣本之間的加權(quán)遺傳距離矩陣(Weighted uniFrac distance)，并進行PCoA分析，結(jié)果如圖2所示。瘤胃微生物群落聚為一類，糞便微生物群落聚為一類，且兩組樣品在第一軸均明顯分開，表明樣品組內(nèi)相似程度要高于組間，且糞便樣品組內(nèi)的相似程度要高于瘤胃樣品。

圖2 基于加權(quán)遺傳距離矩陣計算的PCoA分析Fig.2 PCoA analysis based on matrix calculation by weighted genetic distance

2.3 不同分類水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析

在不同分類水平上對測序所得有效序列進行物種注釋，共得到14個門，21個綱，27個目，44個科，107個屬。根據(jù)物種注釋信息，分別選擇樣品微生物在門分類水平和屬分類水平上相對豐度排名前10位的物種進行柱狀圖比較(圖3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏系綿羊瘤胃和糞便微生物在門分類水平上組成相似，其中擬桿菌門和厚壁菌門是優(yōu)勢菌門；在屬水平上，細菌、理研菌科_RC9_gut_group和瘤胃球菌科_ UCG_010等是優(yōu)勢菌屬。

2.3.1 門水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異 在門分類水平上對兩組微生物群落中相對豐度大于1%的物種進行統(tǒng)計(表2)，其中瘤胃微生物群落中相對豐度大于1%的門有5個，分別為擬桿菌門、厚壁菌門、互養(yǎng)菌門、變形菌門和軟壁菌門，占門水平總豐度的98.74%；糞便微生物群落中相對豐度大于1%的門有8個，分別為厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門、黏膠球形菌門、螺旋體門、變形菌門、藍藻菌門和軟壁菌門，占門水平總豐度的 98.81%。其中，瘤胃中厚壁菌門、疣微菌門、黏膠球形菌門、螺旋體門和藍藻菌門5個門的相對豐度極顯著低于糞便(P<0.01)；而擬桿菌門和互養(yǎng)菌門顯著高于糞便(P<0.05)。

圖3 門水平(A)和屬水平(B)上菌群組成(相對豐度前10)Fig.3 Composition of microbial community at phylum(A)and genus level(B)(top 10 of relative abundances)

表2 微生物相對豐度在門分類水平上>1%的物種Table 2 Relative abundance >1% of microbial species at phylum level

2.3.2 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異 在屬分類水平上對兩組微生物群落中相對豐度大于2%的物種進行統(tǒng)計(表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤胃中相對豐度大于2%的屬有9個，相對豐度最高的為細菌，其次為普雷沃氏菌屬_1、瘤胃菌屬和理研菌科_RC9_gut_group；糞便中相對豐度大于2%的屬有12個，其中豐度最高的為瘤胃球菌科_UCG_010，其次為細菌、理研菌科_RC9_gut_group和瘤胃球菌科_UCG_005。其中，瘤胃中瘤胃球菌科_UCG_010、瘤胃球菌科_UCG_005和擬桿菌屬等9個屬的相對豐度極顯著低于糞便(P<0.01)；而理研菌科_RC9_gut_group、克里斯滕森菌科_R-7_group和普雷沃氏菌屬_1等6個屬顯著高于糞便(P<0.05)。

2.4 微生物基因功能預(yù)測分析

利用PICRUSt軟件對瘤胃和糞便微生物群落進行功能預(yù)測分析。共匹配到43個KEGG二級代謝通路，其中有顯著性差異的代謝通路有34個(P<0.05)。選取相對豐度大于1%的代謝通路共18個進行熱圖比較(圖4)，豐度總和分別占總豐度的94.15%和94.16%。代謝通路主要富集在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細胞過程四大類。對18個代謝通路的相對豐度進行兩組間比較，發(fā)現(xiàn)僅碳水化合物代謝在兩組間差異不顯著(P>0.05)；全局和概述地圖、氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運、脂代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、折疊分揀和降解、萜類化合物和多酮類化合物的代謝和外源物質(zhì)的生物降解與代謝，這8個代謝通路在糞便微生物中豐度較高(P<0.05)；能量代謝、輔因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制與修復(fù)、糖生物合成與代謝、其他氨基酸代謝及次生代謝產(chǎn)物的生物合成和細胞運動，這9個代謝通路在瘤胃微生物中豐度較高(P<0.05)。

表3 微生物相對豐度在屬分類水平上>2%的物種Table 3 Relative abundance >2% of microbial species at genus level

橫坐標(biāo)為組名，縱坐標(biāo)為功能基因的相對豐度。越偏藍色表示相對豐度越高，越偏黃色表示相對豐度越低。ns表示相對豐度值在兩組之間差異不顯著(P>0.05)；*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；***表示差異極顯著(P<0.001)

Abscissa is group name and ordinate is relative abundance of functional genes. The closer to blue the color is, the higher relative abundanceis , while the closer to yellow the color is,the lower relative abundance is.ns=No significant difference(P>0.05); * Significant difference(P<0.05); ** Significant difference(P<0.01); *** Significant difference(P<0.001)

圖4 功能基因預(yù)測熱圖
Fig.4 Heat map of predicted function of microbiota

3 討 論

3.1 瘤胃和糞便的微生物群落多樣性

微生物群落的多樣性往往由α多樣性和β多樣性進行評估。α多樣性反映了樣品中物種的多樣性和豐富度，具體評價指標(biāo)包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)等。其中Chao1和ACE指數(shù)用于衡量物種豐富度即物種數(shù)量的多少；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性。Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品的物種多樣性越高[25]。本研究為了解藏系綿羊瘤胃和糞便微生物的多樣性水平，對Chao 1、ACE、Simpson和Shannon指數(shù)進行計算評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏系綿羊瘤胃微生物的Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于糞便微生物，說明瘤胃中的微生物群落豐富度較高，高豐富度的微生物群落可以使宿主更高效地對所攝入食物進行分解代謝；而Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在兩組之間無顯著差異，說明兩組間菌群多樣性水平相似。王繼文等[26]研究表明，波爾山羊糞便的微生物多樣性要略高于瘤胃，這與本研究結(jié)果相悖，分析產(chǎn)生差異的原因可能是家畜品種和飼養(yǎng)方式不同所造成的，有研究表明在不同精粗比或不同營養(yǎng)水平日糧飼喂下，瘤胃微生物和糞便微生物多樣性水平都會發(fā)生顯著改變[27-28]。微生物群落的β多樣性主要是用以評估樣品間物種多樣性差異，本研究中利用加權(quán)遺傳距離矩陣進行PCoA分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏系綿羊瘤胃微生物菌群能夠很清晰地和糞便菌群區(qū)分開，說明這兩者的菌群分別具有較高的穩(wěn)定性且在微生物結(jié)構(gòu)上具有較大差異。

3.2 瘤胃和糞便微生物在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)差異

Liu等[13]和張雪嬌等[29]研究均表明反芻動物瘤胃微生物中相對豐度較高的優(yōu)勢菌門依次為擬桿菌門和厚壁菌門，這與本研究結(jié)果相同，即瘤胃中擬桿菌門豐度(54.40%±0.80%)顯著高于厚壁菌門(39.40%±0.90%)，但在糞便中卻呈現(xiàn)相反的趨勢，豐度最高的為厚壁菌門(50.30%±0.80%)，其次才為擬桿菌門(36.00%±1.10%)，這也與以往的研究結(jié)果相一致[30]。這種相似性的出現(xiàn)顯示反芻動物胃腸道微生物菌群的共性特征。進一步探究發(fā)現(xiàn)，在屬分類水平上藏系綿羊瘤胃液中豐度較高的菌群為細菌(18.20%± 1.51%)、普雷沃氏菌屬1(12.10%±1.43%)和瘤胃菌屬(12.00%±1.10%)。其中普雷沃氏菌屬1在分類學(xué)上隸屬于擬桿菌門，在瘤胃內(nèi)可以降解淀粉、蛋白質(zhì)、木聚糖等多類營養(yǎng)物質(zhì)，用以能量供給和調(diào)節(jié)機體免疫等[31]，多項研究均證明普雷沃氏菌屬為反芻動物瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌群[32-33]。而在糞便中瘤胃球菌科UCG_010 (17.10%± 1.65%)、細菌(16.30%±0.52%)和理研菌科RC9_gut_group(8.63%±0.54%)豐度排名位于前三位。瘤胃球菌屬在分類學(xué)上隸屬于厚壁菌門，Wang等[34]對小尾寒羊胃腸道不同區(qū)段微生物的動態(tài)變化進行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大腸中瘤胃球菌屬的相對豐度要顯著高于其他胃腸道部位。這與反芻動物后腸所行使的生理功能相關(guān)，后腸中的瘤胃球菌屬能夠產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶等碳水化合物降解酶，用以破壞植物細胞壁，從而實現(xiàn)對碳水化合物的分解發(fā)酵[35]。但從本研究結(jié)果來看，在屬水平仍存在許多未成功注釋到的基因序列，以及相對應(yīng)的基因功能，這就對總體結(jié)果的分析產(chǎn)生了一定影響，后續(xù)可以加入宏轉(zhuǎn)錄組等新興微生物學(xué)分析技術(shù)[36]，以實現(xiàn)對反芻動物胃腸道微生態(tài)環(huán)境的更準確認知。

3.3 瘤胃和糞便微生物功能預(yù)測

使用PICRUSt軟件對藏系綿羊瘤胃和糞便微生物群落進行功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)基因功能主要富集在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細胞過程四大功能類群上。其中碳水化合物代謝在兩組中均富集程度最高且差異不顯著；瘤胃微生物在能量代謝、核苷酸代謝、糖代謝和其他氨基酸代謝等機體代謝功能上顯著富集；糞便微生物在氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運、脂代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能上顯著富集，這與已報道的奶牛胃腸道微生物功能研究結(jié)果相類似[37]，說明瘤胃微生物和后腸中的微生物均參與營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，藏系綿羊瘤胃中微生物的多樣性高于糞便中，瘤胃微生物和糞便微生物在結(jié)構(gòu)組成上相對穩(wěn)定且存在差異。