甘氨酸脫羧酶基因增強子區(qū)(-4.2～-2.2 kb)基因圖譜繪制及其活性檢測

趙爽，鄭華川

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗?zāi)[瘤學(xué)實驗室，遼寧 本溪 117004)

甘氨酸脫羧酶(GDC，P-protein)構(gòu)成甘氨酸裂解系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包含H蛋白，T蛋白和L-蛋白，上述蛋白的構(gòu)成比例為2P:27H:9T:1L[1-2]。該系統(tǒng)催化脊椎動物體內(nèi)甘氨酸裂解的初始階段，產(chǎn)生CO2，NH3,N5,N10-亞甲基和NADH+H+，是甘氨酸代謝的主要途徑；在植物研究中發(fā)現(xiàn)，葉線粒體含有大量的GDC蛋白，主要參與植物光合作用[2-3]593-597。GDC基因突變可導(dǎo)致人類血清甘氨酸累積，最終引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生，如非酮癥性高甘氨酸血癥(NKH)；同時還參與肺癌的形成[4-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，所有的脊椎動物所有組織中，雞與人類的GDC基因結(jié)構(gòu)和功能相似度較高，且雞體內(nèi)甘氨酸裂解活性較強[6]。因此，我們克隆出了雞GDC基因啟動子前(-4.2～-2.2 kb)區(qū)域，繪制其基因圖譜，檢測其對GDC啟動子的調(diào)節(jié)能力。

1 材料和方法

1.1 上游GDC基因KX DNA片段測繪

GDC基因5’端7.3 kb區(qū)域克隆自噬菌體λCPG301，再從GDC基因5’端7.3 kb區(qū)域分離DNA片段-4.2～-2.2 kb。將分離出的DNA片段插入KpnI和XbaI位點之間，并篩選出陽性克隆命名為PBS-KXb。利用KpnI-Pst1、KpnI-HincII、KpnI-HindIII、KpnI-EcoRI、KpnI-SacI、KpnI-XbaI、XbaI-PstI、XbaI-HindIII雙酶切重組質(zhì)粒PBS-KXb并進行瓊脂糖電泳，拍照。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

以pGLΔXbaI-KX(KpnI-XbaI)為載體構(gòu)建KX區(qū)域的截斷體。用HindⅢ-XbaⅠ、PstI-XbaI、EcoRI-XbaI、HincⅡ-XbaI、HincII-HindIII或HincⅡ-KpnI酶切KXB區(qū)域全長或部分DNA片段插入到pBS(-)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌通過菌落PCR或限制性內(nèi)切酶酶切篩選陽性克隆，利用CUGA測序試劑盒測序(日本genetech)，測序引物：T3、T7、MB FW、XK-R-2、XK-R-3、XK-F-2。進一步構(gòu)建pGLΔXbaI-KpnI-XhoI(KX)、HindⅢ-XhoⅠ(HDX/S)、PstI-XhoⅠ(PX)、HindⅢ-XhoⅠ(HDX/L)、EcoRI-XhoI(EX2)、HincⅡ-XhoI(HIX)、HindII-HincIII(HDHI/L)或KpnI-HindII(HIK)并大規(guī)模制備這些質(zhì)粒DNA。

1.3 熒光素酶報告基因檢測

肝癌細胞HepG2利用DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清培養(yǎng)到80%。胰酶消化，離心收集細胞沉淀，計數(shù)，15 000/孔鋪入96孔板，利用轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000(lipofectamine3000)轉(zhuǎn)染野生型或重組質(zhì)粒pGL3-basic及pRL-SV40，48 h后，裂解細胞，利用雙熒光素酶報告基因試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 利用測序引物對KXb全長測序,結(jié)果見圖1，KXb全長2052 bp，含有限制性內(nèi)切酶KpnI、HincII、EcoRI、HindIII、PstI、XbaI。在760～790區(qū)域含有GATA重復(fù)序列。

2.2 本研究利用KpnI和XbaI雙酶切的方法從GDC基因5’端上游-4200～-2200區(qū)域分離出2.0 kb長的DNA片段KXb，并將該片段插入到pBlueScript SK(+/-)載體中，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒PBS-KXb,通過限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)GDC基因上游區(qū)域KXb段含有以下酶切位點KpnI、HincII、EcoRI、HindIII、PstI、XbaI。利用限制性內(nèi)切酶位點構(gòu)建KXb片段的截短體，并將截短體插入到載體pBlueScript SK(-)載體中，成功構(gòu)建以下重組質(zhì)粒pBS(-)KpnI-XbaI(KXb)、HindⅢ-XbaⅠ(HdXb/S)、PstI-XbaⅠ(PXb)、HindⅢ-XbaⅠ(HdXb/L)、EcoRI-XbaI(EXb)、HincⅡ-XbaI(HiXb)、HindII-HincIII(HdHi/L)或KpnI-HindII(Hik)，見圖2。

2.3 構(gòu)建以下截斷體的重組質(zhì)粒pGLΔXbaI、KX(KpnI-XbaI)、HdX/S(HindⅢ-XbaⅠ)、PX(PstI-XbaⅠ)、HdX/L(HindⅢ-XbaⅠ)、EX2(EcoRI-XbaI)、HIX(HincⅡ-XbaI)、HDHI(HindII-HincIII)或HIk(KpnI-HindII)，見圖3。

2.4 將重組質(zhì)粒(截短體)轉(zhuǎn)染到肝癌細胞中，觀察各截短體的熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)KX全長和HDHI/L，HIK兩種截短體熒光素酶活性明顯高于空載體pGLΔXbaI、HDX/L截短體只有輕微升高，其他四種截短體HDX/S、PX、EX2、HIX熒光素酶活性則低于空載體pGLΔXbaI，見圖4。

3 討 論

甘氨酸脫羧酶廣泛存在于真核生物體內(nèi)，植物體內(nèi)的甘氨酸脫羧酶主要參與光合作用，哺乳動物體內(nèi)的甘氨酸脫羧酶則主要參與甘氨酸代謝[2-3]593-597,3692-3697?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸脫羧酶基因突變導(dǎo)致非酮癥性高甘氨酸血癥，這種疾病中，甘氨酸脫羧酶基因突變多出現(xiàn)在該基因的5’端，5’端突變可能影響甘氨酸脫羧酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響甘氨酸脫羧酶的mRNA表達水平[5]e69。雞GDC基因包括25個外顯子，共3572個堿基，處于202503和240569之間，位于Z染色體負鏈上(登錄號：AC202790)[6]3323-3329。UpSp1、InvSp1和下游CP2基序是順式作用原件，可以啟動雞GDC基因轉(zhuǎn)錄，而5’-端區(qū)域-4155/-83包括KX、UpR1S、UpR1A、UpR2S和UpR2A區(qū)域則可能會負向調(diào)節(jié)啟動子活性[7]。所以本實驗主要研究KX(-4200～-2200)區(qū)域，通過測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域確實含有CTTCTT重復(fù)序列，該序列可以通過結(jié)合蛋白，啟動GDC基因轉(zhuǎn)錄[8]。但該區(qū)域含有的其他序列的作用還不明確，所以我們進一步構(gòu)建了多種截短體來探究其調(diào)節(jié)作用。

通過雙熒光素酶報告基因檢測，我們發(fā)現(xiàn)雞GDC基因5’-端區(qū)域-4200/-2200基因片段中，KX全長，HDHI和HIK截短體的熒光素酶活性升高，但是HDX/S、PX、EX2、HIX截短體的熒光素酶活性均有一定程度的降低，KX全長含有完整的調(diào)節(jié)元件，可以啟動GDC基因表達，HDHI和HIK截短體區(qū)域則含有5′-CTTCTT-3′基序也可以啟動GDC基因表達，與Hong S等的研究結(jié)果一致，均可以增強GDC基因啟動子活性[8]10523-10532。但是HDX/S、PX、EX2、HIX截短體的熒光素酶活性降低，則說明HDX/S區(qū)段可能抑制GDC基因啟動子活性。雞GDC基因與人的GDC基因具有一定的相似度，且具有一些相同的原件，可以為人GDC基因的研究提供一定的依據(jù)。

圖1 GDC基因上游KXb區(qū)域基因圖譜

A

B

A：pBS-KX重組質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖電泳，1:1 kb maker;2:KpnI-Pst1;3:KpnI-HincII;4:KpnI-HindIII;5:KpnI-EcoRI;6:KpnI-SacI;7:KpnI-XbaI;8:XbaI-PstI;9:noncut;10:100 bp maker;11:XbaI-HindIII；B：GDC上游KXb區(qū)域酶切圖譜

圖2 GDC上游KXb區(qū)域酶切圖譜

圖3 GDC基因上游KXb區(qū)域截短體熒光素酶報告基因的構(gòu)建

圖4 GDC基因上游KXb區(qū)域截短體的啟動活性檢測

基因組DNA調(diào)取的方法有很多，long and accuracy PCR，genome walking及限制性內(nèi)切酶法調(diào)取DNA[9]，而本研究采用的是酶切法調(diào)取DNA，根據(jù)現(xiàn)有研究預(yù)測GDC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，最后我們利用軟件查找轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)的酶切位點，選擇KpnI和XbaI兩種限制性內(nèi)切酶，調(diào)取GDC基因5’-端區(qū)域-4200/-2200基因，并將該片段插入到PBS(-)載體中，通過單酶切檢測片段長度，進一步用雙酶切鑒定單酶切的結(jié)果，最后得出GDC基因KX區(qū)域的物理圖譜。通過測序驗證調(diào)取DNA的基因序列，繪制GDC基因KX區(qū)域的基因圖譜。酶切法調(diào)取DNA的方法相較于其他方法，用時較短，不易發(fā)生基因突變，結(jié)果的可行度較高，但DNA片段必須為單一限制性內(nèi)切酶，限制了該方法的使用。