矮牡丹與芍藥屬其他5個(gè)種葉綠體基因組特征的比較

周曉君 張 凱 彭正鋒 孫姍姍 押輝遠(yuǎn) 張延召 程彥偉

(1.洛陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 洛陽(yáng) 471934； 2.河南小秦嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局 三門峽 472500；3.洛陽(yáng)牡丹研究院 洛陽(yáng) 471000)

牡丹是芍藥屬牡丹組(Paeoniasect.Moutan)植物的統(tǒng)稱(APG Ⅳ, 2016)。除了以“花中之王”的美譽(yù)供觀賞之外，牡丹還有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值：其根皮“丹皮”為復(fù)方中的常用藥材之一，列入中國(guó)藥典；牡丹籽油富含α-亞麻酸等不飽和脂肪酸，是很有發(fā)展前途的健康食用油之一(洪德元等, 2017)。由于牡丹具有較高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在世界各地廣泛栽培。中國(guó)特有的野生牡丹一直被國(guó)內(nèi)外視為珍貴的種質(zhì)資源，開展野生牡丹系統(tǒng)進(jìn)化的研究以及栽培牡丹起源的研究對(duì)闡明牡丹的起源、培育和改良栽培品種具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值(Zhaoetal., 2008)。葉綠體普遍存在于陸地植物、藻類和部分原生生物中，是進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵場(chǎng)所，是具有自主遺傳信息的重要細(xì)胞器(邢少辰等, 2008)。典型的被子植物葉綠體基因組為環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，即2個(gè)反向互補(bǔ)重復(fù)序列(inverted repeat，IRa和IRb)、大單拷貝區(qū)(large single-copy，LSC)和小單拷貝區(qū)(small single-copy，SSC)。與核基因組相比，葉綠體基因組較小，序列保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，遺傳重組率低，屬于母系遺傳，其結(jié)構(gòu)和序列信息在揭示物種起源、進(jìn)化演變及物種間親緣關(guān)系等方面具有重要價(jià)值(Mccauleyetal., 1996; 王玲等, 2012)。

近年來(lái)，先后有不同學(xué)者對(duì)芍藥屬植物葉綠體基因組進(jìn)行了研究。Zhang等(2016)對(duì)芍藥屬芍藥組(PaeoniaSect.Paeonia)藥用植物川赤芍(P.veitchii)進(jìn)行葉綠體基因組測(cè)序；Li 等(2018)對(duì)芍藥屬牡丹組中僅有的2種開黃花的野生牡丹大花黃牡丹(P.ludlowii)、滇牡丹(P.delavayi)的葉綠體進(jìn)行了測(cè)序并分析其特征；Guo等(2018)對(duì)油用鳳丹牡丹(P.ostii)進(jìn)行了綠葉體測(cè)序并將其與其他幾種芍藥屬植物的葉綠體特征進(jìn)行了對(duì)比。作為7種野生牡丹之一，矮牡丹(P.jishanensis)被認(rèn)為是現(xiàn)代栽培牡丹品種重要的祖先種(Yuanetal., 2014; Xuetal., 2016)。對(duì)矮牡丹葉綠體基因組特征進(jìn)行分析，并將其與已發(fā)表的其他5種芍藥屬植物葉綠體基因組進(jìn)行對(duì)比，旨在為牡丹種質(zhì)資源的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，也可為今后芍藥屬植物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究及種質(zhì)資源的鑒定提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于葉綠體基因組測(cè)序的矮牡丹組織樣本采集于山西省稷山縣馬家溝(35°43′N, 110°58′E)。利用天根試劑盒(天根，北京)提取基因組DNA備用。

1.2 總DNA測(cè)序

將檢測(cè)合格的DNA樣本用超聲波進(jìn)行片段化，經(jīng)純化后進(jìn)行末端修復(fù)、3′端加A及連接測(cè)序接頭，用瓊脂糖電泳選擇合適片段大小。通過PCR擴(kuò)增后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，質(zhì)檢合格的文庫(kù)利用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 組裝與注釋

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)利用CLC Genomics Workbench 9.0軟件(CLC Bio，Aarhus，Denmark)過濾去除低質(zhì)量序列(參數(shù)設(shè)置為：Ambiguous limit=2，Quality limit=0.05)(Wambuguetal., 2015)。以大花黃牡丹葉綠體基因組(KY817592)作為參照(Lietal., 2018)，將過濾后的11 322 016條reads采用Hahn等(2013)的組裝方法構(gòu)建葉綠體基因組。最終得到長(zhǎng)度為152 628 bp的矮牡丹葉綠體全基因組序列。共有145 741條葉綠體reads參與組裝，平均覆蓋率為141.9×。利用Geneious 8.0軟件進(jìn)行矮牡丹與大花黃牡丹序列的CLUSTAL比對(duì)，進(jìn)行堿基修正、修改蛋白質(zhì)和tRNA等注釋，完成葉綠體基因組的分區(qū)。采用OGDraw在線工具(http:∥ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/)進(jìn)行基因組圖譜繪制。

1.4 葉綠體基因組特征分析

圖1 矮牡丹葉綠體基因組物理圖譜

利用MISA(MicroSatellite identification tool)軟件(http:∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索矮牡丹葉綠體基因組中SSR位點(diǎn)并分析其特征。具體參數(shù)為：?jiǎn)魏塑账?、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸為基?Motif)的重復(fù)數(shù)分別設(shè)置為8、5、4、3、3、3，2個(gè)復(fù)合SSR位點(diǎn)間隔堿基數(shù)最大為100。用EMBOSS 6.4.0軟件(http:∥emboss.open-bio.org/)分析蛋白編碼基因密碼子偏好性(Riceetal., 2000)。從GenBank下載鳳丹牡丹、大花黃牡丹、滇牡丹、川赤芍和草芍藥5個(gè)種的葉綠體基因組全序列，與本項(xiàng)目矮牡丹葉綠體基因組序列進(jìn)行多重比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征

與已發(fā)表的其他芍藥屬葉綠體基因組類似，矮牡丹葉綠體基因組為包含LSC、SSC、IRa和IRb 4個(gè)區(qū)段的共價(jià)閉合雙鏈環(huán)狀分子(圖1)，序列全長(zhǎng)152 628 bp，GC含量為38.4%。其中LSC區(qū)段長(zhǎng)84 292 bp，SSC區(qū)段長(zhǎng)17 044 bp，IR區(qū)段為25 646 bp(Zhouetal., 2019)?；蚪M的GC含量是判斷物種間親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，矮牡丹LSC、SSC、IR區(qū)段GC含量與其他芍藥屬一致，分別為36.7%、32.7%、43.1%(Guoetal., 2018; Lietal., 2018)。在基因組大小方面，矮牡丹葉綠體基因組比鳳丹牡丹大475 bp，比川赤芍、大花黃牡丹、滇牡丹和草芍藥分別小54、59、70、70 bp(表1)。

葉綠體注釋結(jié)果表明，矮牡丹葉綠體基因組共有112個(gè)基因，包括蛋白編碼基因78個(gè)、tRNA基因30個(gè)和rRNA基因4個(gè)(表2)。其中，有19個(gè)基因(包括4個(gè)rRNA、7個(gè)tRNA、8個(gè)蛋白編碼基因)在IR區(qū)重復(fù)。LSC區(qū)段含有22個(gè)tRNA基因和60個(gè)蛋白編碼基因，SSC區(qū)段含有1個(gè)tRNA基因和10個(gè)蛋白編碼基因。研究表明，內(nèi)含子在基因的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用，許多內(nèi)含子能夠增強(qiáng)外源基因在植物特定時(shí)間及特定部位的高水平表達(dá)，從而產(chǎn)生相關(guān)的農(nóng)藝性狀(Jiaoetal., 2012)。矮牡丹蛋白編碼基因中，9個(gè)基因(atpF,ndhA,ndhB,petB,petD,rpl16,rpl2,rpoC1,rps16)含有1個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)基因(clpP,rps12,ycf3)含有2個(gè)內(nèi)含子。

表1 芍藥屬6個(gè)種葉綠體基因組基本特征比較①

①LSC: Large single-copy region; SSC: Small single-copy region; IR: Inverse repeats.

表2 矮牡丹葉綠體基因組基因信息①

①*: 具有內(nèi)含子的基因；a: 重復(fù)基因(存在于IR區(qū)域的基因)。*: Genes containing introns; a: Duplicated gene(genes present in the IR regions).

2.2 矮牡丹葉綠體基因組密碼子使用情況

在矮牡丹葉綠體基因組中，共有25 988個(gè)密碼子，編碼蛋白78個(gè)，其中編碼亮氨酸的密碼子數(shù)量最多，為2 716個(gè)，異亮氨酸、色氨酸的密碼子數(shù)量分列第2(2 223個(gè))和第3(1 984個(gè))。TAA為常用的終止密碼子(43個(gè))，略高于TAG(21個(gè))和TGA(21個(gè))。矮牡丹葉綠體基因組中蛋白編碼基因密碼子偏好使用A/T堿基。在所有密碼子中，第1個(gè)、第2個(gè)和第3個(gè)堿基為A/T的分別占總密碼子數(shù)的54.04%、61.59%和68.89%。

2.3 葉綠體基因組SSR分析

在矮牡丹葉綠體基因組中搜索到143個(gè)SSR位點(diǎn)。其中，141個(gè)為普通型SSRs，2個(gè)為復(fù)合型SSRs；單核苷酸重復(fù)Motif位點(diǎn)最多為116個(gè)，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重復(fù)基序分別有13、6、5、1個(gè)，沒有發(fā)現(xiàn)六核苷酸重復(fù)基序(表3)。143個(gè)SSRs位點(diǎn)中，A/T組成的位點(diǎn)有134個(gè)，僅有9個(gè)位點(diǎn)含有G/C，這表明SSRs的堿基組成偏好；從分布區(qū)段上看，14個(gè)位點(diǎn)位于IR區(qū)段，103個(gè)位于LSC區(qū)段，26個(gè)位于SSC區(qū)段，說明矮牡丹葉綠體基因組SSRs分布的不均勻性。

2.4 芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組IR邊界分析

植物葉綠體基因組IR的擴(kuò)張與收縮是較為普遍的現(xiàn)象，它決定了不同植物葉綠體基因組大小(Huangetal., 2014)。為了探索IR潛在的擴(kuò)張與收縮，比較了芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組IR與SC邊界區(qū)域基因的分布狀況(圖2)。如圖所示，LSC/IR和SSC/IR邊界分布的基因包括rps19，rpl2，ycf1，ndhF和trnH。芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組SSC/IRa邊界均為ycf1基因，且在不同的區(qū)域內(nèi)ycf1基因分布長(zhǎng)度不同，在草芍藥、鳳丹牡丹、大花黃牡丹、滇牡丹、川赤芍、矮牡丹的SSC區(qū)域內(nèi)長(zhǎng)度分別為4 325、4 352、4 340、4 355、4 327和4 346 bp，在IRa區(qū)域內(nèi)的長(zhǎng)度分別為1 087、1 078、1 078、1 078、1 076和1 078 bp。同樣地，trnH基因在6個(gè)種中均位于LSC區(qū)域內(nèi)，分別距IRa/LSC邊界1、79、0、1 534、3、3 bp。rpl2基因僅在鳳丹牡丹中位于LSC/IRb邊界，與其他5個(gè)種不同。ndhF基因位于5個(gè)種的IRb/SSC邊界，而在川赤芍中位于SSC區(qū)域距邊界20 bp。

表3 矮牡丹葉綠體基因組SSRs類型信息

圖2 芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組反向重復(fù)區(qū)(IR)、大單拷貝區(qū)(LSC)和小單拷貝區(qū)(SSC)邊界比對(duì)

3 討論

葉綠體基因組序列包含著解決復(fù)雜系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的諸多信息，被廣泛用于植物系統(tǒng)發(fā)育及農(nóng)作物栽培種進(jìn)化關(guān)系重建等領(lǐng)域(Cuénoudetal., 2002; 謝海坤等, 2017)。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測(cè)序成本大大降低，葉綠體基因組獲得更加便捷。大多數(shù)被子植物葉綠體基因組都屬于典型的質(zhì)體基因組4部分結(jié)構(gòu)，即1對(duì)IR區(qū)將整個(gè)基因組劃分成2個(gè)單拷貝區(qū)域；都具有74個(gè)蛋白編碼基因，少數(shù)植物會(huì)在此基礎(chǔ)上增加5個(gè)蛋白編碼基因(Millenetal., 2001)。矮牡丹cp DNA基因組具有蛋白編碼基因78個(gè)、tRNA基因30個(gè)和rRNA基因4個(gè)。通過比較分析矮牡丹與芍藥屬其他5個(gè)種的葉綠體基因組序列可發(fā)現(xiàn)，從基因組大小和基因內(nèi)容來(lái)看，芍藥屬葉綠體基因組高度保守。

密碼子是遺傳信息正確表達(dá)的關(guān)鍵。一般情況下，葉綠體基因組DNA上的起始密碼子序列分別為ATG、ATT、ATA。本研究中矮牡丹葉綠體基因組起始密碼子中除了ATG是最常見起始密碼子外，還有ATA、GTG、ATT 3種類型，這在其他被子植物中也有報(bào)道(Bortirietal., 2008)。不同葉綠體基因組的堿基組成有一定的差異，矮牡丹葉綠體基因組偏向于使用含有A/T的密碼子。密碼子偏好性與生物長(zhǎng)期的進(jìn)化歷史密切相關(guān)，因此研究矮牡丹密碼子的使用情況對(duì)芍藥屬物種進(jìn)化模式的探究具有重要作用。SSR是一種重要的分子標(biāo)記，常用于物種的居群遺傳學(xué)分析(Doorduinetal., 2011)。對(duì)矮牡丹葉綠體基因組中SSR的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，其SSR中含有豐富的A/T，而且多聚的A/T類型遠(yuǎn)大于多聚的G/C類型，與地黃屬(Rehmannia)植物類似(Zengetal., 2017)。矮牡丹葉綠體基因組SSR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)對(duì)芍藥屬植物鑒定、群體水平的多態(tài)性檢測(cè)及系統(tǒng)發(fā)育分析具有一定的意義。

不同物種間葉綠體基因組IR/SC邊界位置的變化是較為普遍的現(xiàn)象，這些變化通常在同一科的物種中也會(huì)有所不同。研究表明，芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組盡管在結(jié)構(gòu)和大小方面比較保守，但不同物種間IR和SC的邊界位置仍有一定變化。與其他5個(gè)種相比，鳳丹牡丹的IR(24 863 bp)是6個(gè)種中最小的，存在收縮現(xiàn)象，這主要表現(xiàn)在LSC/IR的rpl2基因上。該基因在鳳丹牡丹中有718 bp延伸至LSC區(qū)域，而其他種的rpl2基因均完整地位于IR區(qū)。所以芍藥屬LSC/IRb的邊界變化是IR區(qū)擴(kuò)張與收縮的主要原因，這與地黃屬葉綠體基因組的研究結(jié)果一致(Zengetal., 2017)。

芍藥科(Paeoniaceae)在被子植物中十分孤立，其系統(tǒng)位置一直存在激烈爭(zhēng)論。基于分子系統(tǒng)學(xué)的被子植物系統(tǒng)發(fā)生顯示：芍藥科與虎耳草科(Saxifragaceae)、景天科(Crassulaceae)和金縷梅科(Hamamelidaceae)等構(gòu)成一大支，即虎耳草目(Saxifragales)(APG Ⅳ, 2016)。但芍藥科在虎耳草目中究竟與哪類植物最近，仍然是一個(gè)懸而未決的問題(洪德元等, 2017; Jianetal., 2008)。本研究可為今后芍藥科植物系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

芍藥屬6個(gè)種的葉綠體基因組為典型的包含4個(gè)區(qū)段的共價(jià)閉合雙鏈環(huán)狀分子，GC含量均為38.4%，且在LSC、SSC、IR區(qū)段GC含量一致，所有芍藥屬植物葉綠體基因組從長(zhǎng)度到GC含量均高度保守。矮牡丹葉綠體基因組中，共有25 988個(gè)密碼子，編碼亮氨酸的密碼子數(shù)量最多，為2 716個(gè)，矮牡丹葉綠體基因組偏向于使用含有A/T的密碼子。矮牡丹葉綠體基因組中共有143個(gè)SSR位點(diǎn)，單核苷酸重復(fù)Motif位點(diǎn)最多為116個(gè)，SSR中多聚的A/T類型遠(yuǎn)大于多聚的G/C類型。明確了6種芍藥屬植物在每個(gè)區(qū)段的不同，指出LSC/IRb的邊界變化是IR區(qū)擴(kuò)張與收縮的主要原因。