‘冷白玉’棗果實(shí)發(fā)育過程中內(nèi)源激素變化與胚敗育的關(guān)系*

任海燕 王永康 趙愛玲 薛曉芳 弓桂花 杜學(xué)梅 李登科 杜俊杰

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所 果樹種質(zhì)創(chuàng)制與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 太谷 030815; 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 太谷 030801)

棗(Ziziphusjujuba)胚早期敗育現(xiàn)象非常嚴(yán)重，阻滯了棗雜交育種。祁業(yè)鳳等(2004)統(tǒng)計(jì)了《中國果樹志·棗卷》中471個棗種仁發(fā)育情況，敗育率高于50%的品種占58%。劉孟軍等(2009)于2003—2005年連續(xù)3年調(diào)查國家棗資源圃300個棗品種的胚敗育狀況，發(fā)現(xiàn)花后1個月胚敗育率高于90%的品種占33.8%。生產(chǎn)中棗農(nóng)為獲得較高的坐果率，長期運(yùn)用花期開甲技術(shù)，并在花期多次噴施GA，取得了較高的經(jīng)濟(jì)效益(何業(yè)華等，1993；劉孟軍等，2015)。但是，隨著年份、氣候條件的改變(金竹萍，2003)，加之生產(chǎn)中GA的大劑量使用，出現(xiàn)了高比例的胚敗育現(xiàn)象(梁春莉等，2010)。這種高比例的棗胚敗育現(xiàn)象，嚴(yán)重制約了棗常規(guī)雜交育種的進(jìn)程，棗果實(shí)發(fā)生胚敗育的原因有待深入研究。

植物激素與胚敗育有密切的關(guān)系，目前果樹中已有葡萄(Vitisvinifera)(Wangetal., 2012；Reynoldsetal.，2016；Ebadietal.，2016)、荔枝(Litchichinensis)(陳偉等，2000)、芒果(Mangifera)(賀軍虎等，2012；Shabanetal., 2009)等樹種開展了相關(guān)研究。關(guān)于棗胚發(fā)育與激素的關(guān)系也有一些報道：胡芳名等(1998)在長棗(Z.jujuba‘Changzao’)上研究認(rèn)為，幼果果肉中低含量的ABA和IAA可導(dǎo)致棗胚早期敗育；祁業(yè)鳳等(2004)比較了低度敗育型冬棗(Z.jujuba‘Dongzao’)和高度敗育型梨棗(Z.jujuba‘Lizao’)果實(shí)發(fā)育過程中激素水平變化情況，幼胚的正常發(fā)育需要高水平的ZT和IAA，且果肉中高含量的生長類物質(zhì)不利于胚發(fā)育；王玖瑞等(2008)研究了棗雄性不育種質(zhì)果實(shí)發(fā)育期間內(nèi)源激素含量變化，認(rèn)為生長抑制類激素和生長類激素的比值與胚胎發(fā)育有關(guān)。但上述研究主要采用了不同敗育類型的棗品種作為試材。因高敗育棗品種的敗育胚難以取材，無法將敗育胚與正常胚進(jìn)行對比研究，這就給棗胚敗育機(jī)理的研究帶來了極大的困難。

選用具有正常胚和敗育胚的同一棗品種為試材，可避免棗品種間胚發(fā)育時期不一致、敗育胚取材難的問題。目前針對基因型一致的棗品種果實(shí)發(fā)育過程中內(nèi)源激素含量變化的研究還未見報道。本試驗(yàn)以中等敗育品種‘冷白玉’棗為試驗(yàn)材料, 從研究果實(shí)前期的發(fā)育及內(nèi)源激素變化規(guī)律入手，初步探索棗胚敗育機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中等敗育品種‘冷白玉’棗采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國家棗資源圃，該品種盛花期為6月上旬，以黃蕾期(蜜盤剛出蜜)為自然授粉時期，定花定果，采集不同胚齡的幼果。

在前期研究的基礎(chǔ)上，確認(rèn)‘冷白玉’棗20、30、40、50天左右胚齡的幼胚依次正值原胚、小球形胚、球形胚、魚雷形胚，且40天正值敗育高峰期(李登科等, 2016; Renetal., 2019)。采集20、30、40、50天的幼果，每個時期采集50個，觀測果發(fā)育狀況，重復(fù)3次。每個時期采集幼果200個，重復(fù)3次，于冰塊上剝開棗果，觀察胚胎是否敗育，并分為正常胚、敗育胚、胚正常果實(shí)的果肉、胚敗育果實(shí)的果肉共4組；收集材料要快速完成，用錫紙包裹，液氮速凍后-80 ℃保存，用于生長素(IAA)、赤霉素(GA4)、順式脫落酸(cABA)和反式脫落酸(tABA)含量的測定。

判斷胚是否敗育的方法為：剖開果實(shí)觀察，胚珠瘦小、部分組織褐化、變黑、軟化、明顯萎縮皺縮、干癟壞死或胚完全消失為胚敗育果實(shí)，反之則為胚正常果實(shí)。

1.2 試驗(yàn)方法

用電子天平稱量果實(shí)質(zhì)量，游標(biāo)卡尺測量縱、橫徑，取平均值。剝開胚，觀察胚珠發(fā)育狀況。

稱取果肉5.0 g、胚1.0 g進(jìn)行激素含量的測定。每個時期重復(fù)3次。果實(shí)內(nèi)源激素含量用氘代同位素內(nèi)標(biāo)定量計(jì)算法，激素組分用液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-ESI-MSn)定量分析檢測(Liuetal., 2013)，測試在北京林業(yè)大學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

各項(xiàng)指標(biāo)均重復(fù)3次以上，取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理，采用SAS8.0進(jìn)行Duncan’s多重比較(P<0.05)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗幼果及幼胚發(fā)育狀況觀察

‘冷白玉’棗花后10～50天，果實(shí)體積逐漸增大。在20～50天，隨著果實(shí)逐漸增大，胚珠外表皮由綠白色變?yōu)榈S色，種核逐漸木質(zhì)化，胚乳由透明狀變?yōu)槿榘咨腆w狀，胚起初由不可見逐漸微見綠色。在花后20天，胚珠外表皮白色微綠，胚乳透明晶亮(圖1A)；30天胚珠外表皮發(fā)育為白色(圖1B)；40天后胚珠外表皮呈黃白色，有韌性，胚乳呈乳白色(圖1C)；50天胚珠外表皮呈黃白色，核硬化，棗果皮顏色由深綠色逐漸變淺。解剖發(fā)現(xiàn)，正常胚體飽滿而大，而敗育胚不飽滿，且胚珠表面局部或全部褐化(圖1D)。花后40天，棗胚褐變發(fā)生敗育，胚體變黑且失去活性。

圖1 ‘冷白玉’棗果及胚胎發(fā)育情況

2.2 棗果實(shí)生長發(fā)育動態(tài)

由圖2可知，棗果在花后20天，開始快速生長，起初單果質(zhì)量增加較慢，花后30天快速增加；縱徑生長比橫徑生長開始早，速度快，花后30天以后，縱徑生長速度逐漸減慢，而橫徑生長速度增加。50天時縱、橫徑分別達(dá)到成熟果的60%～70%，質(zhì)量為成熟果的58.83%。

圖2 ‘冷白玉’棗果實(shí)的發(fā)育

圖3 ‘冷白玉’棗果中GA4、IAA、cABA及tABA含量的變化

2.3 不同發(fā)育時期‘冷白玉’棗幼果中內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化

2.3.1 GA4含量的變化 由圖3A可知，胚中GA4的含量明顯低于果肉，并一直處于較低的水平。正常胚中GA4含量低于敗育胚?；ê?0天，敗育胚GA4含量開始升高；花后50天，敗育胚含量達(dá)到最大，為0.302 ng·mg-1，且明顯高于正常胚中GA4含量 0.011 ng·mg-1。

在果肉中，胚發(fā)育正常的果肉和敗育果肉中的GA4含量變化規(guī)律基本相似，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(圖3A)。然而，胚正常果肉中，GA4含量在花后40天達(dá)到最大值，為2.560 ng·mg-1；敗育胚果肉中，GA4含量則在花后30天達(dá)到最大，隨后降低，且低于幼胚果肉。

2.3.2 IAA含量的變化 胚中IAA的含量明顯高于果肉。正常胚中IAA含量呈逐漸升高趨勢，花后50天時達(dá)到最大，為15.895 ng·mg-1。而敗育胚中的IAA含量則呈逐漸下降趨勢(圖3B)。

在果肉中，胚敗育的果肉中IAA含量花后30天下降，之后逐漸上升并超過胚正常的果肉，而胚正常的果肉中IAA含量變化呈先上升后下降趨勢，并在花后30天達(dá)到最大值，其后逐漸下降，40天后低于胚敗育果肉中含量。胚正常果肉中IAA含量呈倒V字形，而胚敗育果肉中呈正V字形(圖3B)。

胚敗育果的胚和果肉中IAA含量均呈逐漸下降趨勢，而正常胚中其含量仍保持較高水平，且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于果肉(圖3B)。這與祁業(yè)鳳(2004)對梨棗的研究結(jié)果一致，梨棗果肉中IAA含量20天后呈逐漸下降趨勢，說明幼胚中高水平的IAA有利于胚的正常發(fā)育。

2.3.3 ABA含量的變化 cABA在果肉和胚發(fā)育過程中變化較為一致，均表現(xiàn)為逐漸降低趨勢。在胚正常棗果中，胚中cABA含量大于果肉中的含量；在胚敗育棗果中，則表現(xiàn)為果肉中cABA含量大于胚中的含量(圖3C)。

圖4 ‘冷白玉’棗果中內(nèi)源激素的平衡關(guān)系

胚中tABA的含量高于果肉。正常胚中tABA的含量在胚發(fā)育初期呈下降趨勢，并在50天時達(dá)最低值；而在敗育胚中tABA呈逐漸上升趨勢，并在后期高于正常胚(圖3D)。

胚正常發(fā)育的果實(shí)果肉中和胚中的tABA含量變化表現(xiàn)一致，呈先下降之后緩慢升高的趨勢。而在敗育胚的果肉中呈先下降30天后又上升，在40天出現(xiàn)一個小峰值，之后又下降，并高于胚正常的含量(圖3D)。

2.3.4 內(nèi)源激素平衡關(guān)系對果實(shí)發(fā)育的影響 從圖4A得知，在胚中，花后20～50天，正常胚中(GA4+IAA)/ABA比值逐漸上升，而敗育胚中迅速下降，二者差異顯著。在果肉中，花后20～40天，胚正常果中(GA4+IAA)/ABA的比值呈逐漸上升趨勢，在花后40天，達(dá)到峰值，之后逐漸下降；胚敗育果中(GA4+IAA)/ABA的比值在30天達(dá)到最大，之后迅速下降，在40天后下降趨勢逐漸緩慢。在30～40天，正常胚的果實(shí)中果肉的(GA4+IAA)/ABA比值逐漸上升，而胚敗育的果肉中其比值迅速下降，而此時正值果實(shí)迅速膨大期，胚正常果肉中生長類的激素含量超過抑制類的激素并迅速上升，果實(shí)生長加快，而胚敗育的果肉中抑制類激素超過了生長類激素，果實(shí)生長緩慢。

由圖4B中GA4/ABA值看出，果肉中GA4/ABA大于胚中。在果肉中，胚正常果肉中GA4/ABA呈逐漸增高趨勢；胚敗育果肉中GA4/ABA在30天時達(dá)到峰值，之后降低。而在胚中GA4/ABA較低，正常胚中其變化呈逐漸降低，敗育胚中其變化呈上升趨勢?？梢娫谂咧?，較低的GA4/ABA利于胚的正常發(fā)育，而果肉中較高的GA4/ABA利于棗果的正常生長。

由圖4C可知，胚中 IAA/ABA高于果肉。正常胚中，IAA/ABA不斷增加，敗育胚中，則呈下降趨勢。胚敗育果肉中，IAA/ABA呈先降低后升高趨勢，在胚正常果肉中，在30天出現(xiàn)一個小高峰后逐漸降低，花后40天后，其比值保持平穩(wěn)。可見，果肉中較高的生長促進(jìn)類激素，增加了果肉爭奪養(yǎng)分能力，使得胚獲得養(yǎng)分減少，可能是導(dǎo)致棗胚敗育的重要原因。

從圖4D中IAA/GA4值的變化看出，胚中IAA/GA4遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于果肉。在果實(shí)發(fā)育過程中，果肉中，其比值呈先降低后升高趨勢，而在胚中表現(xiàn)為先升高后降低趨勢，且胚正常型果肉大于胚敗育型果肉，因此初步認(rèn)為，胚中高比值的IAA/GA4利于幼胚的正常發(fā)育。

3 討論

3.1 IAA含量變化與胚發(fā)育的關(guān)系

生長素在生物合成、極性運(yùn)輸和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個層次控制著胚胎的發(fā)育過程(宋麗珍等，2013；翟開恩等，2015)。IAA是胚胎發(fā)育期間主要作用的生長素類物質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中IAA含量的變化被認(rèn)為是胚胎發(fā)生的早期信號，高水平的IAA可以維持較強(qiáng)的胚胎細(xì)胞活性，并通過細(xì)胞伸長來實(shí)現(xiàn)胚的膨大伸長，促進(jìn)胚發(fā)育(Kongetal., 1997；梁艷等，2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，正常胚IAA含量在20～30天即原胚和小球形胚發(fā)育時期緩慢增加，在40天(球形胚)后迅速增加，這可能與分生組織開始發(fā)育前多的IAA來維持更強(qiáng)的胚細(xì)胞活性有關(guān)；而敗育胚中IAA含量變化整體呈下降趨勢，起初緩慢下降，在敗育高峰期花后40天球形期后急劇下降。Cheng等(2007)認(rèn)為，在IAA調(diào)控信號途徑中，低濃度IAA使yuc1yuc4yuc10yuc11四突變體在擬南芥(Arabidopsisthaliana)球形期胚發(fā)生階段受到抑制，從而誘發(fā)胚發(fā)育缺陷?？梢姡琁AA在棗胚發(fā)育過程中起重要作用。本研究結(jié)果中正常胚IAA含量逐漸增高趨勢與在冬棗中的研究結(jié)果(祁業(yè)鳳等，2004)一致，但不同于冬棗胚胎坐果后40天時IAA含量達(dá)到高峰之后維持較高水平的結(jié)果，這可能與不同品種間胚胎發(fā)育時期不同有關(guān)。

果實(shí)中的植物激素來源于種子，種子與果肉中的植物激素相互影響(Kondoetal.，2001)。在本研究中，果肉中IAA含量一直處于較低水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于胚中的含量，這與陳偉等(2000)、祁業(yè)鳳等(2004)的研究結(jié)果相似，而不同于杜維等(2018)沙棘(Hippophaerhamnoides)果中IAA一直保持較高水平的研究結(jié)果。本研究中IAA在棗胚正常果肉中呈先上升后下降，這種變化趨勢與葡萄果肉(Gouthuetal., 2015；高江曼等，2017)中及栗(Castaneamollissima)葉片中(Wangetal.，2012)IAA變化趨勢相似。而在棗敗育胚果肉中IAA含量變化呈正V形，相應(yīng)的敗育胚中則呈逐漸下降趨勢。這很好地說明敗育胚果肉中生長類激素的增加，使得果肉爭奪能力增強(qiáng)，導(dǎo)致種子獲得養(yǎng)分減少，發(fā)生敗育。

3.2 GA4含量變化與胚發(fā)育的關(guān)系

GA被廣泛用于葡萄、草莓(Fragaria×ananassa)、番茄(Lycopersiconesculentum)等果實(shí)的單性結(jié)實(shí)。目前發(fā)現(xiàn)赤霉素136種，其中GA3在促進(jìn)細(xì)胞增長、形成無核果實(shí)等方面有重要的作用(Mesejoetal., 2016)。GA4較GA3的生物活性低，但對于胚軸生長和提高坐果率方面起著重要作用(Curry，2012；杜維等，2018)。對番茄的研究表明，GA4含量的增加受CcGa20oxl基因的調(diào)控，可導(dǎo)致單性結(jié)實(shí)(張映等，2018；Garcia-Hurtadoetal., 2012)。在褪黑素誘導(dǎo)‘紅茄’梨(Pyruscommunis‘Starkrimson’)單性結(jié)實(shí)的研究中發(fā)現(xiàn)，外施褪黑素上調(diào)了子房內(nèi)PbGA20ox并下調(diào)PbGA2ox基因的表達(dá)，使GA3和GA4含量增加，從而誘發(fā)單性結(jié)實(shí)的形成(Liuetal., 2018)。關(guān)于GA4影響棗胚發(fā)育的研究較少。從本研究‘冷白玉’棗果實(shí)發(fā)育過程中GA4的含量變化來看，果肉中GA4的含量明顯高于胚，胚中GA4含量則一直保持較低水平。祁業(yè)鳳等(2004)研究也得出棗果肉中GA3含量高于胚中含量的結(jié)果，但在變化趨勢上有所不同，果肉含量變化表現(xiàn)為逐漸降低的趨勢，不同于本研究中GA4含量呈先升高后降低的趨勢。果肉中高含量的GA可能是多數(shù)棗敗育型品種能繼續(xù)膨大生長的一個原因，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在Adam等(1999)的研究中。王玖瑞等(2008)研究表明，棗雄性不育種質(zhì)胚中GA3含量高于果肉的含量，可能與不同品種間激素水平的差異有關(guān)。關(guān)于棗果的GA4、GA3含量變化在促進(jìn)胚發(fā)育方面哪個發(fā)揮著更重要作用，其作用及其機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

3.3 ABA含量變化與胚發(fā)育的關(guān)系

ABA在促進(jìn)種子成熟期的貯藏蛋白合成方面起著重要的作用，此外還作為胚性狀態(tài)保持劑有維持胚的正常生長發(fā)育等方面的作用(Quatrano, 1987)。研究表明，ABA 在紅松(Pinuskoraiensis)胚胎發(fā)育過程中尤其是中后期的胚胎形態(tài)建成及早期階段起著關(guān)鍵性的作用(梁艷等，2016)。在發(fā)育中后期胚中ABA的急劇上升是導(dǎo)致胚胎敗育的一個重要因素(祁業(yè)鳳等，2004；王玖瑞等，2008)。本研究中花后20～50天棗果發(fā)育階段，胚正常果肉和胚敗育果肉中的總ABA含量均呈下降趨勢，其中胚敗育果肉中總ABA含量高于胚正常果肉，而在胚中，正常胚總ABA含量逐漸下降，敗育胚含量則逐漸增加。這也證實(shí)了在胚發(fā)育中后期總ABA含量的增加與胚敗育有密切的關(guān)系。

天然存在的ABA是一個15碳的倍半萜羧酸，順式脫落酸cABA和反式脫落酸t(yī)ABA互為脫落酸的順反異構(gòu)體，其生理活性取決于C-2處的雙鍵是順式，即cABA是具有生理活性的，而tABA則相對比較穩(wěn)定，在光中異構(gòu)化后才有活性(Bhatlaetal., 2018)。依據(jù)ABA的作用方式劃分為涉及核酸蛋白合成的“慢反應(yīng)”和主要作用在質(zhì)膜上的“快反應(yīng)”。幼嫩的器官中所含的ABA能促進(jìn)依賴于K+的H+/糖的卸載，而在成熟器官中ABA的主要功能可能是與啟動特殊酶和蛋白質(zhì)的合成及膜的泄漏有關(guān)(Qinetal., 1985)。在發(fā)育早期稻(Oryzasativa)胚中研究推測，cABA可能參與了“慢反應(yīng)”，是總ABA庫的鈍化形態(tài)(覃章錚等，1990)。本研究中，果肉和胚中所含cABA含量隨胚的發(fā)育逐漸降低，而tABA含量在中后期有所升高，由此推測在棗胚發(fā)育的中后期，具有活性的cABA可能部分轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的tABA，使得tABA在ABA影響胚發(fā)育的過程中起主導(dǎo)作用。胚敗育和胚正常果肉中cABA含量變化趨勢一致，均呈下降趨勢，而胚中tABA含量高于果肉，在敗育胚中，tABA呈持續(xù)上升的趨勢，在40天后含量高于正常胚，且胚敗育果肉中其含量也高于胚正常果肉。由此推測tABA可能與幼胚早期敗育有關(guān)。

3.4 激素間動態(tài)平衡對幼胚發(fā)育的影響

胚胎發(fā)育不僅與單一內(nèi)源激素含量有關(guān)，還與各類激素之間的平衡，尤其是促進(jìn)生長類激素與抑制生長類激素之間的比例及平衡有關(guān)(許智宏等，2012)。ABA與GA之間存在拮抗作用，它們的相對含量及敏感性在胚發(fā)育過程中起重要作用(楊榮超等，2012；伍靜輝等，2018)。IAA與GA之間相互協(xié)同，GA的合成需要IAA存在，IAA應(yīng)答因子作為GA信號途徑的激活劑，調(diào)控其表達(dá)(Mcateeetal., 2013)。本研究中，棗胚中(IAA+GA4)/ABA比值隨胚的發(fā)育呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，尤其在花后40～50天，即球形胚末期到魚雷形胚快速增加，此時果實(shí)快速膨大，說明這個時期需要更高的生長促進(jìn)激素；反之，(IAA+GA4)/ABA降低，不能滿足幼胚生長所需，導(dǎo)致了敗育的發(fā)生。此外，從(GA4+IAA)/ABA、IAA/ABA、GA4/ABA比值的變化趨勢看，趨勢較為一致，正常胚及其果肉均呈上升趨勢，而敗育胚及胚敗育果肉中均呈下降趨勢。這就意味著GA4、IAA、ABA影響胚胎發(fā)育可能是通過生長抑制激素與生長促進(jìn)激素的平衡，這與在其他果樹上研究的結(jié)果(陳偉等，2000；張新友等，2013)一致。

另外，胚的發(fā)育是由合子經(jīng)過一系列細(xì)胞分裂而形成一個完整成熟胚的過程。作為刺激細(xì)胞分裂和生長作用的細(xì)胞分裂素，在胚的發(fā)育過程中起著重要的作用。陶建敏等(2006)認(rèn)為，生長素和細(xì)胞分裂素的平衡影響胚的發(fā)育。并且較高的ZT、GA和IAA含量能促進(jìn)子房的正常發(fā)育(Zangetal., 2011)。但也有研究認(rèn)為，植物體內(nèi)的GA、IAA、ABA激素變化是由乙烯信號誘導(dǎo)而成的，乙烯是胚敗育的誘導(dǎo)因素(張鳳路等，1999)。關(guān)于植物激素之間的關(guān)系、胚與果肉中各激素如何相互影響的機(jī)制較為復(fù)雜，仍待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

‘冷白玉’棗胚中IAA的含量顯著高于果肉，果肉中GA4的含量高于胚。胚中低水平的GA4、較高水平的IAA及后期低含量的tABA和cABA、高IAA/GA4比值有利于幼胚的正常發(fā)育。胚發(fā)育過程中IAA下降、tABA增加及(GA4+IAA)/ABA比值下降是導(dǎo)致胚敗育的重要因素。棗幼胚發(fā)育前期，需要較高的生長類激素促進(jìn)生長，而在發(fā)育后期則需要一定量的ABA，其中tABA與胚胎早期敗育有關(guān)。