益母縮宮顆粒對(duì)藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮勻漿NO、NOS的影響

吳 敏，何青蘭，李虹秀，李品英，黃正迎，楊 婷，毛 惠

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；3.樂(lè)山市中醫(yī)醫(yī)院，四川 樂(lè)山 614000）

全世界每年大約有8500萬(wàn)例非意愿妊娠，其中50%以流產(chǎn)告終[1]。近年來(lái)，由于米非司酮聯(lián)聯(lián)合索前列醇終止早孕具有成功率高、使用方便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)而成為藥物流產(chǎn)的常用方法。但藥流后常有藥流不完全而導(dǎo)致陰道流血時(shí)間長(zhǎng)和陰道流血量多的并發(fā)癥。我院院內(nèi)制劑益母縮宮顆粒由《傅青主女科》生化湯化裁而來(lái)，由益母草、川芎、枳殼、當(dāng)歸、炮姜、桃仁、生蒲黃組成，具有活血化瘀、促進(jìn)宮縮的作用，前期研究證實(shí)其能有效減少藥物流產(chǎn)后陰道流血時(shí)間，有促進(jìn)惡露排出及輔助子宮復(fù)舊的作用[2][3]，但其對(duì)藥物流產(chǎn)后子宮的作用機(jī)制尚未完全明確，本實(shí)驗(yàn)按照王曉東[4]所述實(shí)驗(yàn)方法造成藥物不全流產(chǎn)大鼠模型，檢測(cè)大鼠子宮勻漿中NO含量及NOS活力尋找本藥對(duì)于模型大鼠子宮可能的作用機(jī)制，為該藥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也為本藥的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)別SD大鼠，雌性60只，雄性30只，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào) SCXK（川）2015-030。雌性大鼠體重210～240 g，雄性大鼠體重250～280 g，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（川）2018-065。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

益母縮宮顆粒，10 g/袋，西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，批號(hào)20181005，大鼠給藥量為低劑量組3.125 g/（kg.d），中劑量組6.25 g/（kg.d），高劑量組12.5 g/（kg.d）。

新生化顆粒，9 g/袋，江蘇仁壽藥業(yè)有限公司，批號(hào)181211，大鼠服藥劑量為2.813 g/（kg.d）。

米非司酮，內(nèi)含米非司酮25 mg/片，華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)431904011，大鼠給藥量為8.3 mg/kg。

米索前列醇，內(nèi)含米索前列醇0.2 mg/片，華潤(rùn)紫竹藥業(yè)有限公司，批號(hào)43190302，大鼠灌胃量為0.1 mg/kg。

水合氯醛，100 g/瓶，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20181201，使用時(shí)用生理鹽水配制成10% 溶液。

所有灌胃藥物均根據(jù)人鼠劑量比換算成大鼠灌胃劑量，成人體重按60 kg計(jì)算。

1.3 實(shí)驗(yàn)所需試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)試劑：總蛋白（TP）測(cè)試盒，A045-2-1；一氧化氮（NO）測(cè)試盒，A012-1-2；總一氧化氮合成酶（NOS）測(cè)試盒，A014-2-2，均由南京建成生物工程研究所提供。

實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫電子水浴鍋，型號(hào)DZKW-4，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；酶標(biāo)儀，型號(hào)SpectraMAX Plus384，美谷分子儀器有限公司；722可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)，型號(hào)UPH-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，型號(hào)SYQ-DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

按照王曉東[4]所述實(shí)驗(yàn)方法造模，將雌雄大鼠于每日下午18：00按2：1合籠，次晨08：00檢查雌鼠陰道，查見(jiàn)陰栓或者陰道分泌物涂片于鏡下查見(jiàn)精子則視為該雌鼠受孕d1，未受孕雌鼠于下午18：00繼續(xù)合籠，連續(xù)合籠一周。

將受孕雌鼠取8只作為空白組分籠喂養(yǎng)，其余受孕雌鼠受孕d7統(tǒng)一造模，受孕d7日晨08：00灌胃米非司酮混懸液0.83 mg/ml，下午18：00灌胃米索前列醇混懸液0.01 mg/ml，空白組大鼠灌胃動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飲用水，灌胃濃度均為1 ml/100g。灌胃米索前列醇后于雌鼠陰道內(nèi)置入定量棉球1枚，次晨檢查大鼠陰道內(nèi)棉球，查見(jiàn)血跡認(rèn)定為造模成功。將造模成功大鼠分為益母縮宮顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組及新生化顆粒組。

各組大鼠均于受孕d8灌胃藥物，實(shí)驗(yàn)組分別灌胃高、中、低濃度益母縮宮顆粒，對(duì)照組灌胃新生化顆粒，模型組及空白組大鼠灌服動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飲用水。連續(xù)灌胃7天，每天1次。

2.2 動(dòng)物標(biāo)本的采集

各組大鼠于開(kāi)始灌胃第8天用水合氯醛按0.35 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，麻妥后將大鼠固定于臺(tái)上，腹部正中行縱切口，逐層開(kāi)腹，鈍性分離周?chē)M織，找到子宮，用眼科剪分離子宮，下自宮頸口，上自子宮末端，離斷子宮，置于天平上進(jìn)行稱重，稱重后將子宮組織置于-80℃冰箱里保存以備制備組織勻漿。

2.3 子宮勻漿中NO含量及NOS活力的檢測(cè)方法

取出子宮組織，梯度溫度解凍，稱取組織塊0.1 g～0.2 g在冰生理鹽水中漂洗除去多余血液及雜質(zhì)，用濾紙拭干組織，稱重，然后放入5 mL的EP管內(nèi)。量取0.9%生理鹽水，按組織質(zhì)量與生理鹽水體積m：v比為1：9的比例加入生理鹽水，然后剪碎組織，用勻漿機(jī)研磨，制成10%組織勻漿。將制備好的組織勻漿用離心機(jī)以3500 r/min轉(zhuǎn)速離心10分鐘，然后留取上清液以備檢測(cè)。按硝酸酶還原法檢測(cè)上清液中NO含量及NOS活力，按照指示盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料用SPSS 23.0進(jìn)行分析，所有資料均為計(jì)量資料，數(shù)據(jù)分布呈正態(tài)分布且方差齊，用“±s”表示，統(tǒng)計(jì)方法使用用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較用LSD-t法進(jìn)行分析。P＜0.05則認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 益母縮宮顆粒對(duì)藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮勻漿NO含量及NOS活力的影響（±s）

表1 益母縮宮顆粒對(duì)藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮勻漿NO含量及NOS活力的影響（±s）

備注：與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與新生化顆粒組相比，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01。

組別 N/只 NO含量（MMOL/GPROT） NOS活力（U/MGPROT）模型組 8 12.698±2.463▲ 1.210±0.142新生化顆粒組 9 9.781±2.786# 1.116±0.177低劑量組 8 13.227±2.271▲▲ 1.231±0.182中劑量組 9 10.956±2.899 1.285±0.234▲高劑量組 9 9.961±2.076# 1.057±0.117

與模型組相比，益母縮宮顆粒高劑量組及新生化顆粒組子宮勻漿中NO含量降低，差異顯著（P＜0.05），益母縮宮顆粒中劑量組子宮勻漿中NO含量有降低趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與新生化顆粒組相比，益母縮宮顆粒低劑量組子宮勻漿中NO含量有所升高，差異顯著（P＜0.01），余組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

與模型組相比，益母縮宮顆粒高劑量組和新生化顆粒組NOS活力有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與新生化顆粒組相比，益母縮宮顆粒中劑量組NOS活力升高，差異顯著（P＜0.05）。

證實(shí)新生化顆粒和高劑量益母縮宮顆粒均能減少模型大鼠子宮勻漿中NO含量，對(duì)NOS活力無(wú)顯著影響，且益母縮宮顆粒對(duì)模型大鼠NO含量呈一定的劑量依賴效應(yīng)。

4 討 論

NO是一類能使平滑肌組織及血管舒張的氣體分子，NO生成后能立即擴(kuò)散到周?chē)钠交〖?xì)胞中，與sGC結(jié)合并激活sGC，在Mg2+的作用下升高平滑肌細(xì)胞的cGMP水平，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度下降，從而導(dǎo)致平滑肌松弛、血管擴(kuò)張[5]。NOS是合成NO必須的物質(zhì)，同時(shí)也是NO合成的限速因子[6]。NO對(duì)也子宮平滑肌的舒張起重要作用，NO含量降低，可通過(guò)促進(jìn)子宮平滑肌收縮，起到止血的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)高劑量益母縮宮顆?？山档湍Ｐ痛笫笞訉m勻漿中NO含量，可能通過(guò)此途徑對(duì)模型大鼠子宮平滑肌起到收縮的作用。

分析各藥物的作用，方中益母草、蒲黃、桃仁、枳殼對(duì)于子宮平滑肌均表現(xiàn)出正性肌力作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，益母草的生物堿和酚酸類化合物有增強(qiáng)大鼠子宮平滑肌收縮的作用[8]，當(dāng)歸具有抑制和促進(jìn)子宮收縮兩種作用[9]；川芎提取液可抑制離體子宮平滑肌的收縮[10]；蒲黃對(duì)離體子宮及在體子宮均表現(xiàn)為促進(jìn)子宮平滑肌興奮作用[11]；桃仁醇提取物能增強(qiáng)豚鼠子宮的收縮作用；枳殼對(duì)家兔子宮表現(xiàn)為興奮作用，使子宮收縮力及緊張度增加。它們共同作用于子宮平滑肌組織，起到促進(jìn)模型大鼠子宮收縮的作用。

前期研究證實(shí)[3]，益母縮宮顆粒能有效減少藥物不全流產(chǎn)大鼠陰道出血時(shí)間及出血量。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，益母縮宮顆?？赏ㄟ^(guò)減少模型大鼠子宮勻漿中NO含量，起到促進(jìn)子宮收縮的作用，可能通過(guò)此途徑起到減少模型大鼠的陰道出血時(shí)間及出血量的作用。但益母縮宮顆粒對(duì)藥物不全流產(chǎn)大鼠的作用機(jī)制仍需進(jìn)行進(jìn)一步深入探索。