響應(yīng)面法優(yōu)化仙茅多糖酶解工藝及體外免疫活性

楊玲 陳陽 楊小生 楊娟

摘要：采用葡聚糖酶對仙茅多糖XMP-1進(jìn)行酶解，并利用響應(yīng)面法對酶解工藝進(jìn)行合理優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計模擬葡聚糖酶酶添加量、酶解溫度、時間、pH值等4個因素對還原糖生成量綜合影響的模型，得到最佳工藝條件，并驗(yàn)證模型的可靠性。通過小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）分析XMP-1 1～12 h酶解得到的12批產(chǎn)物的體外免疫活性。結(jié)果表明，最佳酶解工藝為酶添加量為56%，溫度為52 ℃，酶解時間為12 h，pH值為6.0，此時還原糖生成量為0.201 0 mg/mL。優(yōu)化結(jié)果可靠，與預(yù)測值的相對誤差小于5%。不同時間段酶解產(chǎn)物對細(xì)胞無明顯毒害作用，均能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化，釋放TNF-α和NO，其中酶解5 h的效果最好。該研究可為仙茅多糖酶降解片段的制備提供理論基礎(chǔ)，也可為仙茅多糖在食品領(lǐng)域進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：仙茅;多糖;葡聚糖酶;酶解工藝;響應(yīng)曲面法;體外免疫誘導(dǎo)活性

中圖分類號： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）08-0229-09

收稿日期：2019-03-14

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81460597）;貴州省科技平臺及人才團(tuán)隊計劃（編號：黔科合平臺人才[2017]5614）。

作者簡介：楊?玲（1991—），女，貴州畢節(jié)人，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锍煞旨吧砘钚浴-mail：18275269165@163.com。

通信作者：楊?娟，博士，研究員，主要從事多糖及寡糖研究。E-mail：yangxz2002@126.com。

仙茅作為石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的根莖，是臨床常用的辛熱藥之一，主要用于治療腎陽不足、虛癆內(nèi)傷、腰膝冷痛、筋骨痿軟等虛寒癥狀[1-2]。它的組成成分主要包括酚性化合物及酚苷、三萜皂苷、植物多糖、木脂素苷類、黃酮類化合物、苯環(huán)取代物、揮發(fā)油等[3-4]。藥理研究結(jié)果顯示，仙茅具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、延緩生殖系統(tǒng)老化、抗骨質(zhì)疏松、保肝、保護(hù)心血管等作用[5]，仙茅多糖具有免疫調(diào)節(jié)、對抗腫瘤藥氟尿嘧啶減毒增效、加強(qiáng)青蛙心臟的收縮、抗骨質(zhì)疏松等作用[6]。目前對于仙茅多糖成分的研究只有國內(nèi)外少量文獻(xiàn)報道，且主要研究其藥理作用，而將仙茅多糖酶解為寡糖的研究尚未見報道。

由于多糖是通過其特異性寡聚糖片段與受體相結(jié)合而介導(dǎo)免疫反應(yīng)的，因此對寡聚糖活性片段進(jìn)行研究對探討仙茅多糖作用機(jī)制具有關(guān)鍵作用[7-8]。降解多糖的方法主要有化學(xué)、物理和酶降解法等;酸降解法和氧化降解法是常用的化學(xué)降解法，簡單易行，但是對于降解產(chǎn)物的聚合度難以控制，降解得率低;目前大多數(shù)物理降解方法還只是處于實(shí)驗(yàn)室階段，還需要進(jìn)行更深入的研究;酶降解法與化學(xué)、物理降解法相比，具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物均一性好、聚合度適中、得率高、無污染等優(yōu)點(diǎn)，且能最大程度地保護(hù)反應(yīng)底物的活性基團(tuán)不受破壞[9-10]。選擇合適的降解酶對多糖進(jìn)行酶法修飾，不僅可以更好地探討多糖的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，進(jìn)而探尋多糖的活性中心，而且可為藥物篩選提供各種結(jié)構(gòu)類型的候選化合物[11]。另外，植物多糖雖然來源豐富，性質(zhì)穩(wěn)定，但其分子量大，黏度大，擴(kuò)散困難，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致其的吸收受到阻礙，進(jìn)而使其應(yīng)用范圍受到限制。將植物多糖降解成適宜的、較低分子量的寡糖片段，能夠使其結(jié)構(gòu)更為清晰[12]。寡糖由于結(jié)構(gòu)相對簡單，有人工合成的可能性，其溶解性、穩(wěn)定性和安全性相對較好[13]。因此，對多糖進(jìn)行酶法修飾已成為多糖構(gòu)效關(guān)系研究的重要手段，也是發(fā)現(xiàn)和研制糖類藥物的重要途徑。本研究利用響應(yīng)面法優(yōu)化仙茅多糖葡聚糖酶酶解工藝，并用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分析不同時間段酶解產(chǎn)物的體外免疫誘導(dǎo)活性，以期為仙茅多糖低分子量降解片段的制備提供理論基礎(chǔ)，對深入研究仙茅多糖構(gòu)效關(guān)系及更好地開發(fā)利用仙茅多糖具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?材料與儀器

仙茅，購自貴州省貴陽市萬東橋藥材市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的根，干燥粉碎過40目篩。Sephadex G-50層析柱，美國Pharmacia Sweden公司;DEAE纖維素柱，上海恒信化學(xué)試劑有限公司;小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫;DMWM培養(yǎng)基、胰酶（HyClone，J140032）、Mouse TNF-α ELISA試劑盒（DKW12-2012-096）、NO檢測試劑盒（BLUEGENE，E03N0041），北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二甲基四氮D唑溴藍(lán)（MTT，822A055），北京索萊寶科技有限公司;胎牛血清（FBS，20150914），浙江天杭生物科技股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

自動部分收集器（BS-100A），上海精科實(shí)業(yè)有限公司;紫外可見分光光度計（UV-1800），日本島津儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Buchi R114），Switzerland公司;數(shù)顯恒流泵（HL-2B），上海精科實(shí)業(yè)有限公司;數(shù)顯加熱磁力攪拌器（C-MAG HS 7），德國IKA集團(tuán);酶聯(lián)免疫檢測儀（1510）、水套式CO2培養(yǎng)箱（USA3131），美國熱電公司;倒置顯微鏡（03040108），日本尼康公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?仙茅粗多糖的提取及分離純化

用80%乙醇回流提取仙茅干藥粉2次，每次2 h，除去低聚糖、單糖及脂溶性成分后，按照仙茅干藥粉和蒸餾水的料液比為1 g ∶35 mL，沸水浴提取150 min，然后將提取液濃縮至黏稠狀，5倍無水乙醇醇沉，靜置過夜，干燥得到仙茅粗多糖。對仙茅粗多糖采用DEAE-纖維素柱進(jìn)行層析（Φ12.6 cm×100 cm），流速為5 mL/min，40 min/管，用純凈水進(jìn)行洗脫;再經(jīng)Sephadex G-50凝膠柱層析進(jìn)行純化（Φ 2.6 cm×85 cm），流速為1.2 mL/min，6 min/管，用純凈水進(jìn)行洗脫。凝膠滲透色譜法：Agilent PL aquagel-OH MIXED色譜柱（7.5 mm×300 mm，8 μm），流動相為0.05 mol/L Na2SO4溶液，流速為 1.0 mL/min，溫度為35 ℃，進(jìn)樣量為80 μL，檢測器為示差折光檢測器;用流動相溶解10 mg多糖樣品于10 mL容量瓶中，進(jìn)行高效液相色譜分析。凝膠滲透色譜法測定結(jié)果分析：采用以標(biāo)準(zhǔn)品的相對分子質(zhì)量對數(shù)與對應(yīng)的洗脫體積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品洗脫體積求得其相對分子質(zhì)量[14]。對仙茅多糖純化后樣品進(jìn)行純度鑒定。

1.2.2?仙茅多糖的酶解工藝及評價指標(biāo)

取純化后的仙茅多糖30 mg加5 mL純凈水→50 ℃下攪拌30 min使其充分溶解→加入16.8 mg葡聚糖酶、15 mL pH值為6的KH2PO4/K2HPO4緩沖液→52 ℃ 下反應(yīng)12 h→沸水浴15 min終止反應(yīng)→過濾→濃縮至10 mL→酶解產(chǎn)物的混合物。

從酶解產(chǎn)物中分別移取2 mL置于30 mL具塞試管中，加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液 3 mL，混合均勻后，沸水浴7 min，急速冷卻，補(bǔ)水至25 mL。以還原糖含量為指標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.801 1x+0.006 8（r2=0.999 8，線性范圍為0.08～0.48 mg/mL），計算酶解產(chǎn)物的還原糖含量。

1.2.3?仙茅多糖酶解工藝的單因素試驗(yàn)

考察酶添加量、溫度、時間、pH值對仙茅純多糖酶解得到的還原糖含量的影響。在酶解溫度為55 ℃、時間為10 h、pH值為5.5條件下，設(shè)酶添加量分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%;在酶添加量為50%、時間為10 h、pH值為5.5條件下，分別設(shè)酶解溫度為10、20、30、40、50、60、70 ℃;在酶添加量為50%、溫度為50 ℃、pH值為5.5條件下，分別設(shè)酶解時間為3、6、9、12、15、18 h;在酶添加量為50%、溫度為50 ℃、時間為 12 h 條件下，分別設(shè)pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，對仙茅多糖酶解工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4?響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素考察基礎(chǔ)上，以酶添加量（A）、溫度（B）、酶解時間（C）、pH值（D）為自變量，還原糖生成量為響應(yīng)值。采用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行4因素5水平星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)[15-16]，具體見表1。

在含有10%胎牛血清（FBS）、1 mL 10.25%胰酶的90% DMEM培養(yǎng)基接種小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞，在溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)[17]。在酶添加量為56%、溫度為52 ℃、pH值為6.0條件下，試驗(yàn)組為100 mg仙茅純多糖酶解1～12 h，分別得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h等12批酶解產(chǎn)物濃縮干燥，配制成濃度為31.250、125.000、500.000 μg/mL 溶液;空白組（BC）：以DMEM培養(yǎng)基作為空白對照;多糖組（XMP-1）：將未酶解的濃度為 125.00 μg/mL 的仙茅多糖溶液命名為XMP-1，作為多糖組。以每孔106個細(xì)胞的濃度將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔（100 μL/孔）細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入試驗(yàn)組、空白組和多糖組溶液各100 μL，置于溫度為 37 ℃、CO2濃度為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育 48 h。細(xì)胞孵育完成后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培育 4 h 后終止培養(yǎng)，吸取上清，每孔加150 μL二甲基亞砜DMSO，低速（100 r/min）搖床10 min，靜置 20 min，待結(jié)晶溶解后用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測吸光度。根據(jù)以下公式計算細(xì)胞存活率。

存活率=（D藥物-D本底）/（D正常-D本底）×100%。

1.2.6?RAW264.7細(xì)胞免疫因子TNF-α測定

細(xì)胞接種同“1.2.5”節(jié)。于溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、36、48 h，細(xì)胞孵育完成后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清;然后根據(jù)小鼠TNF-α ELISA kit說明手冊中進(jìn)行操作，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=224.13x-98.989，r2=0.988 6）計算細(xì)胞因子TNF-α的濃度[18-19]。

1.2.7?酶解組分誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化釋放免疫因子一氧化氮（NO）

采用Griess法測定RAW264.7細(xì)胞釋放的NO量[20]，細(xì)胞接種同 “1.2.5” 節(jié)。于溫度為37 ℃、CO2濃度為5.0%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、36、48 h后，加入100 μL Griess試劑[含3 mmol/L磺胺酸，30 mg/L N-1-（萘基）乙二胺二鹽酸鹽，質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%冰乙酸]，室溫避光孵育20 min，離心取細(xì)胞上清液，用酶標(biāo)儀于 450 nm 處測定吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=73.86x-3.506，r2=0.988 2）計算NO含量。

1.2.8?數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

活性試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.00進(jìn)行分析，并與空白對照組進(jìn)行比較。

2?結(jié)果與分析

2.1?仙茅粗多糖的分離純化

運(yùn)用DEAE纖維素柱對20 g仙茅粗多糖進(jìn)行初步純化，用純凈水洗脫自動收集器分部收集，苯 酚- 硫酸法檢測，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，得到一個單一峰（圖1），收集單一峰對應(yīng)部分溶液并濃縮，經(jīng)Sephadex G-50凝膠柱進(jìn)一步純化，用純凈水洗脫，收集吸光度最大的單一峰對應(yīng)的物質(zhì)，濃縮干燥，命名為XMP-1（圖2）;經(jīng)凝膠滲透色譜分析發(fā)現(xiàn)，色譜峰為單一對稱峰（圖3），可判斷所得純化產(chǎn)物為分子量分布均一的多糖。

2.2?單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1?酶添加量對還原糖生成量的影響

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)還原糖的生成量與酶添加量呈正相關(guān)關(guān)系，在酶添加量為50%時達(dá)到最大值。因此選擇50%為酶添加量最佳值。

2.2.2?酶解溫度對還原糖生成量的影響

酶活性的發(fā)揮存在最適合的溫度，低于或超過該值，酶活性的發(fā)揮都會受到影響。從圖5可以看出，當(dāng)溫度在50 ℃以下時，溫度的增加有利于還原糖的生成。因此選擇50 ℃為酶解溫度最佳值。

2.2.3?酶解時間對還原糖生成量的影響

從圖6可以看出，在酶解時間為12 h內(nèi)，還原糖的產(chǎn)生量隨酶解時間的增加迅速增加，說明葡聚糖酶對 XMP-1的作用有一個逐漸修飾的過程;在酶解時間為12 h之后，還原糖稍有生產(chǎn)量減少。因此酶解時間為12 h最為合適。

2.2.4?pH值對還原糖生成量的影響

從圖7可以看出，在pH值為6.0時，還原糖生成量達(dá)到極大值，說明葡聚糖酶活性的發(fā)揮有最佳的pH值，越接近該pH值，越有利于酶活性的發(fā)揮。因此選擇6.0為pH值最佳值。

2.3?響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1?星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)和結(jié)果

基于單因素考察結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面-星點(diǎn)設(shè)計法優(yōu)化仙茅多糖酶解工藝，結(jié)果見表2、表3，其中表2為星點(diǎn)設(shè)計試驗(yàn)和結(jié)果，表3為多糖酶解優(yōu)化工藝所建立回歸方程的方差分析。

2.3.2?回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

通過Design-Expert 8.0.5b軟件對表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸二項(xiàng)式擬合，得到的方程為Y=-0.91605+1.55458A+7.18988×10-3B+0.065132C+0.037327D-1.75421×10-3AB-3.60074×10-3AC+6.83217×10-3AD-1.38490×10-5BC+3.87772×10-5BD-3.97004×10-4CD-1.40070A2-6.00698×10-5B2-2.401 74×10-3C2-3.006 98×10-3D2，R2=0.999 1，其中Y為還原糖生長量，可以看出，方程可信度較好，可以較準(zhǔn)確地評估多糖的酶解工藝。從表3可以看出，模型的P值小于0.000 1，說明試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著，該模型具有較好的分析預(yù)測意義。失擬項(xiàng)的P值等于 0.343 3，大于0.05，說明它對試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著，說明方程擬合程度較好，可用于預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。各因素方差分析結(jié)果顯示，對于一次項(xiàng)和二次方項(xiàng)：酶添加量、溫度、酶解時間、pH值及其各自二次方項(xiàng)皆對還原糖生成量的影響極顯著（P<0.001）;對于交叉項(xiàng)：酶添加量和溫度的交互作用對還原糖生成量的影響極顯著（P<0.001）;酶添加量和酶解時間的交互作用、酶添加量和pH值的交互作用、酶解時間和pH值的交互作用對還原糖生成量的影響高度顯著（P<0.01）;溫度和pH值的交互作用對還原糖生成量的影響不顯著（P>0.05）;表明各因素與還原糖生成量之間不是簡單線性關(guān)系。由F值可得，4因素對還原糖生成量的影響次序?yàn)槊柑砑恿?酶解時間>溫度>pH值。最優(yōu)條件是酶添加量為56%，溫度為 52.32 ℃，酶解時間為12.46 h，pH值為6.36，此時還原糖生成量期望值為0.201 9 mg/mL。

2.3.3?響應(yīng)曲面分析

采用軟件Design-Expert獲得響應(yīng)值的3D曲面，分析各因素對還原糖生成量的影響及各因素間的交互作用，即當(dāng)固定酶添加量、溫度、酶解時間、pH值中任意2個因素為零水平時，其他2個因素間的交互作用對還原糖生成量的影響。從圖8可以看出，還原糖生成量隨其中任意2個因素量的增加均呈上升趨勢，達(dá)到一定值之后，稍下降或趨于平緩。各因素之間具有交互作用。

2.3.4?驗(yàn)證與優(yōu)化

通過響應(yīng)面法優(yōu)化XMP-1的最佳酶解條件，結(jié)合實(shí)際操作，將優(yōu)化條件調(diào)整為酶添加量56%、溫度52 ℃、酶解時間12 h、pH值 6.0，在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)，平行檢測5次，所測的還原糖生成量為0.201 0 mg/mL，與期望值的相對誤差在5%以內(nèi)，二者較吻合。所以該方法能較好優(yōu)化XMP-1的酶解條件，具有較好的可信度。

2.4?不同時間段酶解產(chǎn)物的體外免疫誘導(dǎo)活性

2.4.1?不同時間段的酶解產(chǎn)物對細(xì)胞的毒性作用

不同時間段的酶解產(chǎn)物分別孵育48 h后對RAW264.7細(xì)胞毒性作用見圖9。通過光學(xué)顯微鏡觀察XMP-1對RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XMP-1對RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)沒有造成明顯的影響。XMP-1在31.250～500.000 μg/mL濃度范圍內(nèi)，孵育48 h后對細(xì)胞的生長不會造成明顯影響。所以濃度在500.00 μg/mL以內(nèi)的XMP-1對RAW264.7細(xì)胞是安全無毒性的，可以作為后續(xù)試驗(yàn)的濃度設(shè)定上限，這對于各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)的判斷都具有重要的意義。

2.4.2?不同時間段的酶解產(chǎn)物誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌TNF-α的結(jié)果

孵育24、36、48 h后，不同時間段的酶解產(chǎn)物對RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響見圖10。不同時間段的酶解產(chǎn)物均能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌TNF-α，且誘導(dǎo)活性呈現(xiàn)濃度依賴性。酶解5 h的組分誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的作用，孵育36 h和48 h時不同濃度的誘導(dǎo)作用均強(qiáng)于多糖組。

2.4.3?不同時間段的酶解產(chǎn)物誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化釋放NO的結(jié)果

孵育24、36、48 h后，不同時間段的酶解產(chǎn)物誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化釋放NO的結(jié)果見圖11。結(jié)果表明，XMP-1不同時間段的酶解產(chǎn)物均可有效誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌NO，孵育36、48 h時，酶解4、5 h的酶解產(chǎn)物在不同濃度條件下都能較好地促進(jìn)細(xì)胞NO的分泌，且都優(yōu)于多糖組。

3?討論與結(jié)論

運(yùn)用葡聚糖酶對XPM-1進(jìn)行酶解，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上考察了XMP-1經(jīng)葡聚糖酶酶解的最佳條件， 運(yùn)用星點(diǎn)設(shè)計法構(gòu)建了各酶解條件因素對XMP-1酶解工藝的影響模型，結(jié)果表明，該方法擬合程度較好，模型具有設(shè)計意義;酶添加量、酶解時間的適當(dāng)增加以及適宜的pH值和溫度都能增加還原糖的生成量;4因素對還原糖生成量的影響次序?yàn)槊柑砑恿?酶解時間>溫度>pH值。將優(yōu)化條件修正為酶添加量為56%，溫度為 52 ℃，酶解時間為12 h，pH值為6.0后，還原糖量生成量為 0.201 0 mg/mL，與期望值的相對誤差在5%以內(nèi)，可信度較高，可用于XMP-1酶解工藝的優(yōu)化。體外免疫誘導(dǎo)活性分析結(jié)果表明， 濃度為 500 μg/mL 以下，孵育時間48 h以內(nèi)，酶解產(chǎn)物對細(xì)胞沒有明顯的毒害作用;不同時間段酶解產(chǎn)物均可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α和NO，其中酶解5 h的組分免疫誘導(dǎo)活性較其他時間段效果好。本研究結(jié)果可為仙茅在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)利用及工藝化生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

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