基于山梨酸鉀衍生多孔碳修飾電極用于橙皮素檢測

李可欣，陳泇冰，潘永全*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動物中心，重慶 400016；2.湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

橙皮素(Hesperetin，HSP)是一種蕓香科柑橘屬的二氫黃酮類天然產(chǎn)物，常見于柑橘類植物的果皮及果肉中[1-2]。橙皮素結(jié)構(gòu)中的酮羰基、醚基、甲氧基及酚羥基使得其具有一定的藥理活性，如降血糖、降血脂、降血壓、抗炎、抗菌、抗腫瘤及心血管保護(hù)等作用[3-9]，常被用于藥品及食品添加劑以發(fā)揮其藥理作用。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道橙皮素具有潛在的抗高尿酸血癥活性，主要機(jī)制是橙皮素作為一種天然黃嘌呤氧化酶抑制劑，可通過抑制黃嘌呤氧化酶和黃嘌呤脫氫酶的活性，從而減少尿酸生成，對于高尿酸血癥具有一定的防治作用[10]。因此，亟待開發(fā)一種高效快速的橙皮素定量檢測方法。常見的橙皮素含量測定方法有高效液相色譜法[11]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12]、毛細(xì)管電泳法[13]、紫外分光光度法[14]及熒光分析法[15]。相比于上述方法，電化學(xué)法具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好、前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于橙皮素的快速及高靈敏度檢測[16]。目前，運(yùn)用電化學(xué)法檢測橙皮素的報(bào)道相對較少，利用電化學(xué)法研究橙皮素在電極表面的反應(yīng)機(jī)理及痕量測定具有一定的研究意義和應(yīng)用前景。

多孔碳常被用作電極修飾材料，其通常通過硬模板法制備而成[17]。然而，近年來報(bào)道采用有機(jī)鹽類熱解制備多孔碳的研究引起了廣泛關(guān)注。如Zhu等[18]通過將檸檬酸鐵和NH4Cl混合，利用檸檬酸鐵的有機(jī)部分作為碳源，NH4Cl既作氮源又作致孔劑，制備了一系列N摻雜的多孔碳并用于超級電容器的制作；Sun等[19]通過將NaCl及谷氨酸鈉混合，利用NaCl作為模板，谷氨酸鈉作為碳源，制作了分級互連的多孔碳材料，并將其應(yīng)用于鋅離子空氣電池；Sun等[20]通過常見的兩步法利用海藻酸鉀熱解，制備出一種三維互連的多孔碳，由于其大的比表面積及豐富的含氧官能團(tuán)，從而在超級電容器研究中表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)性能。然而，利用有機(jī)鹽類通過一步熱解方法制備的多孔碳多用于超級電容器及鋰離子電池方面[21]，鮮有在電化學(xué)分析方面的應(yīng)用報(bào)道。由于多孔碳具有較大的比表面積、多孔特性及優(yōu)異的電化學(xué)性能，使得其在電化學(xué)分析領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

山梨酸鉀(PS)作為一種常見的防腐劑，具有低毒性、吸濕性及易氧化性[22]?；谄浞栏踩?、低毒、穩(wěn)定的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各類食品保鮮。然而，山梨酸鉀在吸潮和氧化后易變色及變質(zhì)，廢棄的山梨酸鉀不再具有防腐性能[23]。因此，使用山梨酸鉀通過一步熱解法制備多孔碳，不僅能達(dá)到資源循環(huán)利用、環(huán)境保護(hù)的目的，同時(shí)也是一種簡便快速制備多孔碳的方法。

本文利用山梨酸鉀通過一步熱解法制備出三維互連的多孔碳材料，構(gòu)建了一種基于其衍生的多孔碳修飾電極(PSIPC-900/GCE)，并利用CV及EIS研究了其電化學(xué)特性。考察了橙皮素在該修飾電極上的行為，通過DPV對其含量進(jìn)行測定以及對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測。本課題組前期工作顯示橙皮素對高尿酸血癥具有一定治療作用，并通過動物實(shí)驗(yàn)考察了其藥理機(jī)制。本文從橙皮素的酚羥基及甲氧基結(jié)構(gòu)出發(fā)，進(jìn)一步考察了其在PSIPC-900/GCE的電化學(xué)行為，并將PSIPC-900/GCE用于橙皮素的測定。本文提出的電化學(xué)傳感器方法操作簡便、靈敏度高，具有一定的抗干擾及穩(wěn)定性，為橙皮素的檢測提供了一種新思路，具有一定的研究價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI-660e電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；Hitachi S4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；Shimadzu XRD-7000 X射線衍射儀(日本島津公司)；Tecnai G20 透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；EscaLab 250Xi X射線光電子能譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)；Thermo ESCALAB 250XI光電子能譜儀(美國賽默飛世爾科技)；Quantachrome Autosorb iQ全自動氣體吸附儀(美國康塔儀器公司)；LabRAM HR800拉曼光譜儀(法國Horiba Jobin Yvon)；KH2200E型超聲波(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無水乙醇、山梨酸鉀(分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司)；抗壞血酸、尿酸、葡萄糖、鳥嘌呤(分析純，國藥試劑有限公司)；橙皮素(HSP，分析純，美國Sigma-Aldrich公司)；PBS溶液以0.1 mol/L的KH2PO4和0.1 mol/L的Na2HPO4按不同比例配制，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g)9只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(渝)-2017-0001。在室溫 20～25 ℃ ，相對濕度( 50±5) % 的條件下飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、進(jìn)水。取尿液前禁食12 h，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取4 g山梨酸鉀置于剛玉坩堝，并將其置于管式爐中，于氮?dú)夥諊乱?0 ℃/min升溫至900 ℃，保溫3 h，冷卻至室溫后取出，得到黑色粉末樣品。將黑色粉末樣品置于0.1 mol/L鹽酸中，攪拌12 h以除去殘留的金屬及金屬鹽。使用水及乙醇各洗滌3次，置于60 ℃烘箱干燥12 h。得到山梨酸鉀衍生的多孔碳PSIPC-900。在同樣條件下于700 ℃及800 ℃下制備得到黑色粉末樣品，記作PSIPC-700和PSIPC-800。

PSIPC-900/GCE的制備如下：取10 mg PSIPC溶于10 mL DMF中，超聲3 h得均勻分散的PSIPC分散液。用氧化鋁粉末將玻碳電極打磨3 min拋光成鏡面，分別置于硝酸(1∶1)、無水乙醇和水中各超聲3 min，在氮?dú)饬飨麓蹈?，用移液槍? μL滴涂在打磨拋光的玻碳電極表面，滴涂后的電極置于45 ℃烘箱干燥，修飾電極記為PSIPC-900/GCE。

所有的電化學(xué)檢測均在室溫下用標(biāo)準(zhǔn)的三電極體系進(jìn)行，GCE和PSIPC-900/GCE作為工作電極，鉑電極作為輔助電極，甘汞電極作為參比電極。CV電化學(xué)測試窗口為0.2～0.9 V，掃速為100 mV/s；DPV電化學(xué)測試窗口為0.2～0.9 V，掃速為100 mV/s，脈沖振幅為25 mV，脈沖寬度為0.05 s，平衡時(shí)間為5 s，脈沖頻率為10 Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1 PSIPC的SEM、TEM、XRD、XPS、TGA及N2吸附-脫附表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM)對PSIPC的形貌進(jìn)行表征。圖1A、B、C分別為PSIPC-700、PSIPC-800及PSIPC-900的SEM圖。如圖所示，不同溫度下制備的多孔碳材料均具有較多孔道，且孔道分散均勻。隨著溫度增加，在其表面形成了更多微孔，同時(shí)由于碳壁破裂，其大孔孔徑也隨之增大。PSIPC表面除具有較多互相連接的大孔，還具有較多的微孔，這種獨(dú)特的孔道結(jié)構(gòu)在增加其比表面積的同時(shí)，還能提供更大的活性位點(diǎn)和縮短離子擴(kuò)散距離，從而更有利于電化學(xué)信號的傳輸。

圖1 不同溫度下3種PSIPCs的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of three PSIPCs at different temperaturesA.PSIPC-700，B.PSIPC-800，C.PSIPC-900

圖2為PSIPC-900的透射電子顯微鏡(TEM)圖。如圖2A所示，PSIPC-900由互相連接的多孔形成三維孔狀結(jié)構(gòu)，其孔徑約為200 nm。圖2B為PSIPC-900的高分辨透射電鏡圖(HRTEM)，顯示其表面具有較多微孔及介孔，這主要?dú)w因于活潑金屬K在氣化過程中對碳材料表面產(chǎn)生刻蝕作用，同時(shí)有機(jī)部分熱解過程中產(chǎn)生的CO2及CO也為微孔及介孔的產(chǎn)生做出一定貢獻(xiàn)。圖2C為PSIPC-900的選區(qū)電子衍射圖(SAED)，圖中顯示有兩個(gè)微弱的衍射環(huán)，這可歸因于碳的(002)及(100)面衍射。

圖2 PSIPC-900的透射電鏡圖(A)、高分辨透射電鏡圖(B)及選區(qū)電子衍射圖(C)Fig.2 TEM(A)，HRTEM(B) and SAED(C) images of PSIPC-900

圖3A為PSIPC-900的X-射線衍射圖譜(XRD)。如圖所示，在2θ=24°及44°處出現(xiàn)兩個(gè)較寬的衍射峰，這可歸屬于石墨的(002)及(100)晶面[24]，表明在900 ℃下制備的多孔碳材料PSIPC-900已完全碳化，證明已發(fā)生了高溫下的碳化過程。

圖3 PSIPC-900的XRD圖譜(A)、X射線光電子能譜(B)及C1s高分辨率圖譜(C)Fig.3 XRD spectra(A),XPS spectrum(B) and high-resolution XPS spectra(C) of C1s for the PSIPC-900 insert:XRD spectrum of potassium sorbate

圖4 山梨酸鉀的熱重分析曲線Fig.4 Thermogravimetric analysis curve of potassium sorbate

采用熱重分析(TGA)考察了山梨酸鉀的熱分解過程(見圖4)，如圖所示，TGA 曲線在270～500 ℃及750～850 ℃出現(xiàn)兩個(gè)失重平臺。第一段失重主要由于山梨酸鉀的分解及碳酸鉀的形成；第二段失重為碳酸鉀的分解，碳酸鉀分解過程為K2CO3→ K2O+CO2，K2O+C → 2K+CO，CO2+C → 2CO[25-26]。其分解過程產(chǎn)生的金屬K及氣體CO、CO2為材料的微孔和介孔的產(chǎn)生做出了貢獻(xiàn)，此結(jié)果與前述分析一致。

圖5為PSIPC-900的N2吸附-脫附曲線圖(A)及孔徑分布分析圖(B)。如圖所示，在相對壓強(qiáng)0 ～0.4時(shí)吸附曲線與脫附曲線相重合，表現(xiàn)出明顯的Ⅰ/Ⅳ型吸附等溫線，表明材料中含有微孔及介孔。在孔徑分布曲線(圖5B)中，可以觀察到在1.5、4.3、8.5、13.4、21.0、31.7 nm處的6個(gè)峰，這表明材料有微孔及介孔，其比表面積為1 024.3 m2,巨大的比表面積及豐富的孔道為HSP的吸附提供了更多的活性位點(diǎn)。

圖5 PSIPC-900的氮?dú)馕?脫附圖(A)及孔徑分布曲線(B)Fig.5 N2 adsorption and desorption isotherm(A) and distribution of pore size(B) for PSIPC-900

圖6 不同電極在5 mmol/L Fe[(CN)6]3-/4-存在下0.1 mol/L KCl溶液中的EIS圖Fig.6 EIS plots obtained of different electrodes for 5 mmol/L Fe[(CN)6]3-/4- in 0.1 mol/L KCl

2.2 修飾電極的電化學(xué)表征

考察了PSIPC-900/GCE在5 mmol/L Fe[(CN)6]3-/4-存在下0.1 mol/L KCl的EIS圖(見圖6)。由于EIS曲線由高頻區(qū)的半圓及低頻區(qū)的直線組成，它們分別代表了電子轉(zhuǎn)移過程及擴(kuò)散過程，因此EIS圖的半圓直徑可表明電極表面電子轉(zhuǎn)移電阻的大小。如圖所示，GCE的半圓直徑明顯大于修飾電極PSIPC-900/GCE，表明PSIPC-900/GCE具有更高的電子傳輸能力。這主要?dú)w因于多孔碳PSIPC-900材料的高導(dǎo)電性、較大的比表面積及豐富的孔道分布。

2.3 HSP在修飾電極上的電化學(xué)行為

采用CV及DPV考察了HSP在修飾電極PSIPC-900/GCE的電化學(xué)行為(圖7)。結(jié)果顯示，對單獨(dú)的0.1 mol/L PBS(pH 2.0)溶液進(jìn)行CV掃描時(shí)(曲線c)，PSIPC-900/GCE中未出現(xiàn)氧化還原峰，表明電極在此電位窗口下穩(wěn)定；曲線a和b為10 μmol/L HSP存在于0.1 mol/L PBS(pH 2.0)時(shí),PSIPC-900/GCE和GCE的CV曲線，可觀察到在526 mV/548 mV處出現(xiàn)1對氧化還原峰(p1/p2)，在784 mV(p3)出現(xiàn)1個(gè)單獨(dú)的不可逆氧化峰，且曲線a的氧化峰電流值明顯高于曲線b。這主要?dú)w因于PSIPC-900多孔碳材料的良好導(dǎo)電性、較大的比表面積及豐富的孔徑分布為HSP提供了更多的活性位點(diǎn)。其中，HSP在PSIPC-900/GCE上的電化學(xué)反應(yīng)機(jī)理如下：p3氧化峰的產(chǎn)生可能與六元環(huán)中的羥基及甲氧基有關(guān)，而p1與p2峰的產(chǎn)生可能歸因于p3氧化產(chǎn)物的鄰位羥基的氧化還原反應(yīng)(圖7C)[16]。圖7B為10 μmol/L HSP存在于0.1 mol/L PBS(pH 2.0)時(shí)，GCE及PSIPC-900/GCE的DPV曲線，其結(jié)果與CV相一致。上述研究結(jié)果表明，PSIPC-900可用作高靈敏檢測HSP的電極材料。

圖7 不同電極在含有10 μmol/L HSP 的0.1 mol/L PBS(pH 2.0)中的CV(A)，DPV(B)圖及HSP的電極反應(yīng)機(jī)理(C)Fig.7 CV(A),DPV(B) curves of different electrodes in 0.1 mol/L PBS(pH 2.0) containing 10 μmol/L HSP,and electrode reaction mechanism of HSP in PSIPC-900/GCE(C)a:PSIPC-9/GCE,with 10 μmol/L HSP;b.GCE,with 10 μmol/L HSP;c.PSIPC-9/GCE,without 10 μmol/L HSP

2.4 PSIPC材料熱解溫度及分散液濃度的影響

采用不同熱解溫度制備的PSIPC-700、PSIPC-800及PSIPC-900，分別制備成其對應(yīng)的電極PSIPC-700/GCE、PSIPC-800/GCE及PSIPC-900/GCE，并掃描其在10 μmol/L HSP存在下的DPV圖。結(jié)果顯示，PSIPC-900/GCE的峰電流值明顯高于PSIPC-700/GCE和PSIPC-800/GCE，這主要?dú)w因于在700 ℃及800 ℃下制備的碳材料表面仍存在一定的K2CO3，相比于PSIPC-900的電化學(xué)活性更低，因此選擇PSIPC-900作為修飾材料。進(jìn)一步考察了PSIPC-900分散液不同修飾濃度(0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 g/L)對10 μmol/L HSP的DPV信號的影響。結(jié)果顯示，在濃度為1.0 g/L時(shí)，其氧化峰電流達(dá)到最大，因此選擇1.0 g/L作為PSIPC-900分散液的最優(yōu)修飾濃度。

圖8 pH值對10 μmol/L HSP在PSIPC-900/GCE上信號強(qiáng)度的影響Fig.8 Effect of pH value on oxidation peak current of 10 μmol/L HSP on PSIPC-900/GCEinsert：linear fit of pH value and peak potential

2.5 pH值對HSP檢測的影響

采用DPV法考察了不同pH值(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)對10 μmol/L HSP峰電位信號的影響。結(jié)果顯示，隨著pH值的增加，其峰電位逐漸負(fù)移且峰電流值逐漸降低(圖8)，因此選擇pH 2.0的0.1 mol/L PBS作為最優(yōu)pH值。研究顯示，在此pH范圍內(nèi)，峰電位與pH值呈線性關(guān)系，其線性方程為Ep(V)=0.628-0.053 pH(r2=0.999)，斜率值接近理論能斯特斜率值-0.059，表明HSP在該電極上的電化學(xué)反應(yīng)過程質(zhì)子數(shù)與電子數(shù)相同。

2.6 掃描速率的影響

2.7 方法的線性范圍與檢出限

在最優(yōu)條件下，以DPV法使用PSIPC-900/GCE對不同濃度(0、0.05、0.1、0.4、0.7、1.0、4.0、7.0、10.0、15.0 μmol/L)的HSP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以確定其線性范圍及檢出限。結(jié)果顯示，HSP的峰電流值隨著其濃度的增加而增加，且 HSP濃度在0.05 ～15.0 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性擬合方程為Ipa=8.293c+2.268(r2=0.999)，靈敏度為116.4 A·mol/L-1·cm-2，檢出限為0.021 μmol/L。相比于文獻(xiàn)報(bào)道的HSP檢測方法，本文所構(gòu)建的電化學(xué)傳感器具有更高的靈敏度及更寬的檢測范圍(見表1)。

表1 不同檢測方法對HSP檢測性能的比較Table 1 Performance comparison of different detection methods for HSP

2.8 方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及選擇性

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將修飾電極PSIPC-900/GCE放置1個(gè)月后，采用DPV法對10 μmol/L HSP進(jìn)行重新測試，其氧化峰電流變化2.4%，表明電極具有較好穩(wěn)定性；采用同一根PSIPC-900/GCE修飾電極對10 μmol/L HSP重復(fù)測定10次，其電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.2%，表明電極有較好的重復(fù)性。

2.9 實(shí)際樣品的測定

為了考察PSIPC-900/GCE對實(shí)際樣品測定的可行性，實(shí)驗(yàn)采用DPV法對大鼠尿液進(jìn)行測定。大鼠尿樣處理如下：將9只正常SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=3)，置于代謝籠中，實(shí)驗(yàn)前禁食 12 h，自由飲水，并同時(shí)收集空白尿液，將其置于離心機(jī)中，以13 000 r/min離心10 min除去尿樣中的蛋白質(zhì)，待上清液尿酸濃度稀釋至5.0 μmol/L，置于4 ℃條件下備用。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對3種不同濃度(1.0、5.0、10.0 μmol/L)的HSP進(jìn)行測定，測得回收率分別為96.4%、104%、98.2%，RSD分別為2.1%、4.6%、2.6%，表明 PSIPC-900/GCE可用于實(shí)際樣品中HSP的測定。

3 結(jié) 論

本文以山梨酸鉀作為碳源，在900 ℃下通過熱解法制備了一種互連多孔碳材料PSIPC-900，通過該多孔碳材料制備成電化學(xué)傳感器PSIPC-900/GCE，考察了HSP在該修飾電極上的電化學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該修飾電極可用于HSP的高靈敏度測定，且檢測范圍廣。本研究為HSP含量的測試提供了新思路，同時(shí)也為HSP對高尿酸血癥的后續(xù)藥理機(jī)理研究提供了一種新的檢測方法。