高效液相色譜法測(cè)定土壤中6種鄰苯二甲酸酯的含量及其生物有效性的評(píng)價(jià)

劉成霞，朱 洋，劉綠葉

(上海實(shí)樸檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海200100)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是一類常用的塑化劑，可增加塑料的柔韌性和強(qiáng)度，因此廣泛應(yīng)用于食品包裝、兒童玩具、化妝品、紡織品和生物醫(yī)學(xué)設(shè)備等軟質(zhì)塑料中[1-3]。PAEs可通過(guò)多種途徑污染環(huán)境，如大氣、飲用水、土壤、食品包裝材料等，土壤中的塑化劑主要來(lái)源于農(nóng)膜及其他廢棄塑料制品的攜入。PAEs及其代謝產(chǎn)物和降解產(chǎn)物對(duì)人體健康的危害很大，不但會(huì)損傷人體肝臟、腎臟、生殖器官，還會(huì)干擾人體正常內(nèi)分泌，影響體內(nèi)荷爾蒙含量，長(zhǎng)期在體內(nèi)積累還可能會(huì)導(dǎo)致畸形、癌變和細(xì)胞突變[4-6]。美國(guó)環(huán)保署將6 種PAEs列為優(yōu)先控制的重點(diǎn)污染物，包括鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁基芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DNOP)。塑化劑的測(cè)定主要集中在塑料容器以及塑料包裝材料中，但近年來(lái)，一些不法商販利用塑化劑的增塑特點(diǎn)將塑化劑代替起云劑和乳化劑加入到食品，甚至藥品中[7]。對(duì)土壤中塑化劑的測(cè)定及其生物有效性的同步研究較少。

土壤中的PAEs能夠被植物和無(wú)脊椎動(dòng)物吸收，并通過(guò)食物鏈在動(dòng)物和人體內(nèi)累積，食物中的污染物從食品基質(zhì)中釋放后進(jìn)入消化液，由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)入靜脈，繼而轉(zhuǎn)移到靶器官發(fā)揮毒性作用[8]。體外胃腸模擬法可以利用人工配制的消化液，模擬人體的胃和腸的消化過(guò)程來(lái)分析污染物的生物有效性[9-11]。通常只有部分有機(jī)污染物溶解在胃腸液中，這部分被認(rèn)為是可能被人體吸收，即生物有效態(tài)的部分[12]。測(cè)定土壤中有機(jī)污染物的生物有效性對(duì)評(píng)價(jià)其暴露風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要[13]。本工作以體外胃腸模擬法為基礎(chǔ)，分析土壤中PAEs的生物有效性，為評(píng)價(jià)其健康風(fēng)險(xiǎn)和污染管控提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，配可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；梅特勒S220型p H 計(jì)；0.45μm 有機(jī)過(guò)濾膜。

6種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:100 mg·L－1。

胃液:稱取1.25 g胃蛋白酶，0.50 g蘋果酸鈉，0.50 g檸檬酸鈉，加入420μL 乳酸和500μL 乙酸溶解后，用乙酸定容至1.000 L，并用50%(體積分?jǐn)?shù))鹽酸溶液調(diào)節(jié)p H 至2.5[14]。

甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

Zorbax Eclipse C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)，柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積20μL；流量1 m L·min－1；測(cè)定波長(zhǎng)245 nm。流動(dòng)相:A 為乙腈，B 為水。梯度洗脫程序:0～5 min 時(shí)，A 為70%；6～10 min時(shí)，A 由70%升至95%，保持10 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

分別稱取10.000 g土壤樣品于2個(gè)50 m L 玻璃瓶中，第一份樣品中加入10 m L 胃液，在37 ℃下，以100 r·min－1轉(zhuǎn)速振蕩提取1 h，模擬胃液的消化過(guò)程。胃液提取結(jié)束后，用碳酸氫鈉(粉末)調(diào)節(jié)消化液p H 至7.0，加入55.0 mg膽汁鹽和15 mg胰液素即得腸液，然后在37 ℃下，以100 r·min－1轉(zhuǎn)速繼續(xù)振蕩2 h，完成腸液的提取。提取結(jié)束后，以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液加入10 m L甲醇，超聲提取30 min。按同樣方法操作進(jìn)行空白試驗(yàn)。另一份樣品中加入10 m L甲醇，超聲提取30 min，按同樣方法操作進(jìn)行空白試驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后向兩份提取液中加入足量硫酸鎂和氯化鈉，以4 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液定容至10.0 m L，經(jīng)0.45μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 生物有效性計(jì)算

污染物的生物有效性的計(jì)算見(jiàn)公式(1):

式中:xB為污染物的生物有效性；ρ1為污染物從基質(zhì)中釋放到胃腸模擬液中的質(zhì)量濃度，mg·L－1；ρ2為基質(zhì)中污染物的總質(zhì)量濃度，mg·L－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按色譜條件對(duì)10.0 mg·L－1的6種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 6種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of 6 PAEs

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)以乙腈-水二元溶劑體系為流動(dòng)相，采用了Zorbax Eclipse C18色 譜 柱(4.6 mm×250 mm，5.0μm)分離，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，摸索出有效分離6種PAEs的梯度洗脫程序，并考察了不同流量對(duì)分離6種PAEs的影響。初始，乙腈與水的比例為70∶30，以5 m L·min－1速率將乙腈的比例升至95%；因DMP和DEP 的保留時(shí)間較接近，控制流量為1 m L·min－1，在10 min 內(nèi) 可 有 效 分 離DMP、DEP、BBP；在10～20 min 時(shí)，保持乙腈的比例為95%，DBP 和DEHP 的保留時(shí)間相差較大，可在20 min內(nèi)分離6種PAEs。選擇合適的梯度洗脫程序，可有效降低基線漂移對(duì)6種PAEs的影響，獲得較好的分離效果。試驗(yàn)選擇的流量和梯度洗脫程序見(jiàn)1.2節(jié)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

移取適量的100 mg·L－16種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用 乙腈稀釋成0.10，0.50，1.00，2.50，5.00，10.0 mg·L－1的6種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以6種PAEs的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:6種PAEs的質(zhì)量濃度均在0.10～10.0 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

按色譜條件對(duì)2.50 mg·L－1的6種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算7次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按照公式(2)計(jì)算方法的檢出限:

式中:XMDL為方法檢出限；n 為樣品的平行測(cè)定次數(shù)；t 為自由度為n－1，置信度為99%時(shí)的t 分布(單側(cè))；s 為n 次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。當(dāng)n＝7，置信度為99%時(shí)，t＝3.143。方法的檢出限結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品(HTSB-4)、地表土壤樣品、農(nóng)田土壤樣品進(jìn)行分析，均未檢出6 種PAEs。對(duì)上述土壤樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行測(cè)定7 次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝7)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝7)

由表2可知:回收率為95.6%～96.4%，RSD 為0.22%～0.56%。

2.5 土壤中PAEs的生物有效性

對(duì)土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品(HTSB-4)加標(biāo)(加標(biāo)量為1.00 mg·L－1)，其生物有效性結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知:不同PAEs的生物有效性存在一定差別。PAEs脂溶性越高，其生物有效性越低。其主要原因?yàn)槟壳绑w外胃腸模擬法是基于污染物在介質(zhì)和消化液中的平衡分配原理進(jìn)行的，污染物的生物有效性與其辛醇-水分配系數(shù)有關(guān)。在體外胃腸模擬試驗(yàn)中，沒(méi)有足夠的親脂性物質(zhì)提供吸附力使得親脂性有機(jī)污染物由固體顆粒釋放到胃腸模擬液中，從而降低了它的轉(zhuǎn)化。

表3 土壤中6種PAEs的生物有效性Tab.3 Biological availability of 6 PAEs in soil

2.6 土壤理化參數(shù)對(duì)PAEs生物有效性的影響

影響污染物對(duì)土壤生物毒性的因素主要包括:礦物質(zhì)種類(影響化合物吸附)、粒徑分布(影響表而積)、水含量(影響化合物分配和可利用性)、滲透度(影響傳輸能力)、結(jié)構(gòu)(影響孔隙率)、酸度、溫度、金屬含量、含碳有機(jī)質(zhì)(TOC)、孔隙率(影響滲透性)、密度(決定孔體積，受土壤中礦物質(zhì)含量和種類、有機(jī)質(zhì)、土壤結(jié)構(gòu)影響)、無(wú)機(jī)離子、污染歷史等[15]。試驗(yàn)對(duì)某地土壤進(jìn)行了研究，分析方法參照《全國(guó)土壤污染狀況詳查土壤樣品分析測(cè)試方法技術(shù)規(guī)定》第三部分《土壤理化性質(zhì)分析測(cè)試方法》。結(jié)果表明:某地土壤樣品中DEHP 檢出率較高，主要原因在于DEHP是應(yīng)用最為廣泛的增塑劑，其辛醇-水分配系數(shù)較高，不易降解，易被土壤吸附，同時(shí)其生物有效性較低，造成持久性污染。土壤理化性質(zhì)與生物有效性的相關(guān)性見(jiàn)表4。

由表4可知:待測(cè)土壤樣品生物有效性與含水率、濕密度成反比，與TOC 有一定的相關(guān)性，這與文獻(xiàn)[16]研究結(jié)果一致。

本工作采用高效液相色譜法測(cè)定土壤中6 種PAEs的含量，方法精密度高、準(zhǔn)確可靠。同時(shí)以體外胃腸模擬法分析土壤中PAEs的生物有效性。人體胃腸道具有復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)，當(dāng)食物等介質(zhì)進(jìn)入以后，污染物不斷從介質(zhì)上解吸附下來(lái)，然后被胃腸道吸收。但在靜態(tài)的體外胃腸模擬試驗(yàn)中，達(dá)到消化平衡后，并沒(méi)有存在像活體一樣的吸收過(guò)程，這會(huì)限制污染物從介質(zhì)上的解吸附。因此，這種基于平衡分配原理的靜態(tài)體外模擬試驗(yàn)測(cè)得的生物有效性可能會(huì)低于活體試驗(yàn)測(cè)得的生物有效性。本工作為PAEs體內(nèi)代謝提供前期參考，在后續(xù)的研究中建議采用液相色譜-質(zhì)譜法或同位素示蹤法對(duì)體內(nèi)代謝物進(jìn)行分析，并結(jié)合毒性因子，完善評(píng)價(jià)土壤中PAEs生物有效性的方法。

表4 土壤理化性質(zhì)與生物有效性的相關(guān)性Tab.4 Correlation between physical and chemical properties of soil and biological availability