川西地區(qū)雞滑液囊支原體分離株的部分生物學特性及其VlhA 基因遺傳進化分析

李 凡，張煥容，陳云霞

（西南民族大學 生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041）

雞滑液囊支原體病又稱傳染性滑膜炎，是由滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）引起雞和火雞的一種常見、多發(fā)性急慢性傳染病[1]。MS 主要侵害雞關(guān)節(jié)的滑液囊和腿鞘，引起滲出性滑膜炎、腿鞘炎，特征病變?yōu)殛P(guān)節(jié)、腱鞘和腳掌腫脹[2]。MS 具有水平傳播和垂直傳播的特性[3-4]。各品種的雞均易感，造成雛雞、青年雞生長發(fā)育遲緩及胴體降級，產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能下降，雞群殘次率增加，嚴重的易繼發(fā)其它疾病而死亡[5-7]。由于支原體分離培養(yǎng)極為困難，雖四川地區(qū)雞MS 臨床疑似感染病例很多，但還未見四川地區(qū)雞MS 分離鑒定等相關(guān)研究報道。本研究對川西部分地區(qū)75 份臨床疑似MS 感染病雞的樣本進行了PCR 檢測，并對檢測為陽性的病料進行MS 的分離鑒定及生物學特性研究，對分離株的VlhA 基因進行遺傳進化分析，旨在了解川西地區(qū)肉雞場MS 的感染情況，獲取MS 地方分離株，為該病的防控提供基礎(chǔ)材料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參考菌株及主要試劑 雞滑液囊支原體參考株GX11-T，購自中國獸藥監(jiān)察所；改良Frey 培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司；PCR 預混液購自大連寶生物工程公司。

1.2 疑似MS 感染雞臨床病變觀察及樣本采集 觀察并記錄臨床疑似MS 感染雞的病變，采集川西地區(qū)的4 區(qū)市15 個雞場75 份臨床疑似MS 感染病雞的咽拭子、胸部滑液囊、跗關(guān)節(jié)、腿鞘和腳底膿腫組織和分泌物樣本。樣本詳細信息如表1。

表1 疑似MS 感染病雞的樣本信息Table 1 Sample information of suspected MS infected chickens

1.3 病料處理及DNA 提取 取病料組織樣品約0.05 g 于研磨器中剪碎研磨，加入1 mL 生理鹽水稀釋混勻后轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管中，8 000 r/min 離心2 min 取上清；咽拭子樣品置于無菌生理鹽水中，渦旋震蕩混勻后直接吸取上清，使用酚氯仿法提取病料組織及咽拭子上清中的DNA。

1.4 臨床樣本的PCR 檢測 以VlhA 基因為模板，采用石曉磊[8]設計的引物，MSF：5'-TTAGCAGCTAG TGCAGTGGCC-3'/MSR：5'-GTAACCGATCCGCTTAAT GC-3'由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增片段長度為300 bp，同時以MS參考株GX11-T作為陽性對照。PCR 反應條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃1 min，共30 個循環(huán)；72 ℃10 min。反應結(jié)束后，PCR 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 MS 的分離 取PCR 檢測為MS 陽性的樣本，加入終濃度為2 000 IU 氨芐過夜處理，接種于改良Frey 固體培養(yǎng)基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察。待平板上觀察到煎蛋樣菌落后，在10×4 倍顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，取菌落經(jīng)瑞氏染色后鏡檢觀察菌體形態(tài)；同時挑取單菌落接種于改良Frey 液體培養(yǎng)基中，37 ℃5%CO2培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃時收獲并傳代。

1.6 分離菌吸附雞紅細胞的試驗 將5 mL 0.25%雞紅細胞懸液加入直徑35 mm 的固體培養(yǎng)板上疑似MS培養(yǎng)物的表面，輕搖混勻，室溫下作用20 min 后棄紅細胞懸液，用生理鹽水洗滌固體培養(yǎng)板3 次，在10×4 倍顯微鏡下觀察菌落表面有無紅細胞吸附。

1.7 分離菌生長滴度測定—顏色改變單位法（CCU）將MS 分離菌分別用改良Frey 氏液體培養(yǎng)基經(jīng)10 倍倍比稀釋（101～1010），同時設置加生理鹽水的液體培養(yǎng)基為陰性對照，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，記錄每管顏色變化（以培養(yǎng)基顏色由猩紅變成橘黃的最終管稀釋度作為活菌的CCU），測定各分離株的CCU。

1.8 雞胚致病性試驗 復蘇凍存的分離株，12 000 r/min 離心收集菌體，用PBS 重懸菌體，經(jīng)卵黃囊接種于7 日齡SPF 雞胚，每個分離菌株共接種3 枚雞胚，接菌量為5×105CCU/胚，另設3 枚雞胚注射等量PBS 作對照。雞胚置37 ℃繼續(xù)孵化，每日觀察并記錄雞胚死亡情況，對死亡雞胚剖檢，分別采集死亡雞胚尿囊液、卵黃囊、胚體和肝組織，用酚氯仿法提取DNA，使用1.4 的引物進行PCR 檢測，從采集的組織中重新分離MS，方法同1.5。

1.9 分離株vlhA 基因的PCR 擴增及遺傳進化分析將分離的MS 煮沸提取DNA，使用MSF/MSR 引物進行PCR 鑒定。采用丁美娟等[9]設計的引物：F:5'-GC CATTGCTCCTGCTGTTATA-3'/R: 5'-GGGTAGTCCACT CGCATT-3'，PCR 擴增MS VlhA 基因片段，預期目的片段大小為773 bp，產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定。對擴增的vlhA 基因序列和GenBank 參考株相應基因序列進行同源性和系統(tǒng)進化分析。

2 結(jié) 果

2.1 部分發(fā)病雞臨床癥狀及剖檢病變 疑似感染MS 的病雞臨床表現(xiàn)為行動障礙、臥地不起、跗關(guān)節(jié)、胸部滑液囊腫大。剖檢可見跗關(guān)節(jié)腔、胸部滑液囊、爪墊有淡黃色分泌液或黃色干酪樣分泌物。初步懷疑該場病雞感染了MS。

2.2 臨床樣本的PCR 檢測結(jié)果 以采集的75 份疑似MS 感染病雞的咽拭子、胸部滑液囊、跗關(guān)節(jié)、腿鞘和腳底膿腫組織和分泌物樣本的DNA 為模板，對其進行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，75份樣本中MS核酸陽性樣本為31 份，陽性率為41.33%（31/75），15 個疑似感染MS 雞場中11 個雞場PCR 檢測陽性，場陽性率73.33%（11/15）。部分樣品的PCR 擴增結(jié)果如圖1。表明川西地區(qū)肉雞場存在較高的MS 感染率。

圖1 部分待檢樣本的PCR 擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of some samples for test

2.3 分離株菌落及菌體形態(tài)觀察 對PCR 檢測為陽性的樣本進行MS 分離，培養(yǎng)至5 d 時可在低倍鏡下看到固體培養(yǎng)基上形成的“煎蛋樣”菌落（圖2 A）；MS 分離株經(jīng)瑞氏染色后油鏡下觀察可見圓形或橢圓形菌體（圖2 B）；挑取單菌落至液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，2 d 后培養(yǎng)基顏色變黃。結(jié)果表明分離的病原可能為MS，從11 個PCR 陽性雞場中的3 個雞場共分離到9 株病原菌，分別命名為SMU-SCPS-LF1/2018、SMU-SCPS-LF2/2019、 SMU-SCYA-LF1/2019、 SMUSCPS-LF3/2018、SMU-SCPS-LF4/2018、SMU-SCPSLF5/2018、 SMU-SCPS-LF6/2018、 SMU-SCPS-LF7/2018、SMU-SCPS-LF8/2018，其中SMU-SCPS-LF2/2019、SMU-SCYA-LF1/2019 分離自兩個不同雞場，其余7 株分離自同一個雞場。

圖2 分離菌SMU-SCPS-LF2/2019菌落形態(tài)（A）及菌體形態(tài)（B）Fig.2 Colony morphology(A)and cell morphology(B)of isolate SMU-SCPS-LF2/2019

2.4 分離菌株吸附雞紅細胞試驗結(jié)果 對固體培養(yǎng)基上的分離株菌落進行雞紅細胞吸附試驗，顯微鏡40 倍放大觀察可見菌落上吸附的雞紅細胞（圖3），表明分離菌對紅細胞有吸附能力。

2.5 分離株生長滴度測定（CCU）結(jié)果 將MS分離菌分別用改良Frey 氏液體培養(yǎng)基經(jīng)10 倍倍比稀釋后培養(yǎng)，每日觀察顏色變化，觀察至第14 d。結(jié)果顯示，3個雞場9 株分離菌株的活菌數(shù)分別為104CCU/mL～106CCU/mL，以SMU-SCYA-LF1/2019、SMU-SCYALF5/2018 兩株的活菌數(shù)相對最高，為106CCU/mL（表2）。

2.6 雞胚致病性試驗結(jié)果 分離株以5×105CCU 接種7 日齡SPF 雞胚，雞胚于接種后7 d～9 d 均死亡，陰性對照未死亡，死亡雞胚尿囊液、卵黃囊、胚體和肝組織經(jīng)PCR 檢測均能檢測到MS，且均分離回收到了接種菌株。剖檢發(fā)現(xiàn)死亡雞胚肝臟出血，表明分離株具有較強的致病性。

圖3 分離菌SMU-SCPS-LF2/2019 的雞紅細胞吸附試驗結(jié)果Fig.3 Chicken hemadsorption test results for isolate SMU-SCPS-LF2/2019

表2 MS 分離株活菌計數(shù)結(jié)果Table 2 Results of viable bacterial count of 9 isolates

2.7 分離菌株VlhA 基因的PCR 擴增及其遺傳進化分析 以提取的MS 分離菌株的DNA 為模板，使用MSF/MSR 引物進行PCR 鑒定。結(jié)果顯示，9 株分離菌株經(jīng)PCR 擴增均出現(xiàn)目的條帶（圖4）。表明9 株分離菌均為MS。

圖4 MS 分離株VIhA 基因的PCR 擴增結(jié)果Fig.4 The amplication results of VIhA gene in MS isolates by PCR

9 株MS 分離株VlhA 基因測序結(jié)果與GenBank 參考株相應基因序列的同源性分析結(jié)果顯示，9 株分離株之間的同源性為86.1%～99.9%，與參考株的同源性為86.2%～95.4%，分離自同一個雞場的7 株MS之間的同源性為96.4%～99.9%，與分離自另外兩個雞場的兩株MS 同源性為85.5%～90.8%，同源性分析結(jié)果表明MS 分離株變異較大。

經(jīng)MEGA 軟件構(gòu)建的9 株MS 分離株與GenBank登錄的MS 參考株VlhA 基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，分離自2 個不同雞場的分離株SMU-SCYA-LF1/2019、SMU-SCPS-LF2/2019 和GenBank 中 登 錄 的 中國分離株聚為一小支，與本研究中采用的參考株GX11-T 聚為一大支，親緣關(guān)系最近；分離自同一雞場的7 株MS 菌株與伊朗烏爾米耶、伊朗克爾曼和以色列分離株聚為1 支（圖5）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明：川西地區(qū)MS 流行菌株既有與中國流行株親緣關(guān)系較近的菌株，也有與國外流行株親緣關(guān)系較近的菌株，親緣關(guān)系復雜。

圖5 MS 分離株VlhA 基因進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of VlhA gene of MS isolates

3 討 論

雞滑液囊支原體病通常采用血清學、微生物學或分子生物學診斷方法[10-11]。血清學方法成本相對較低，但特異性或敏感性不足，分離鑒定法費時費力[12]。以PCR 為基礎(chǔ)的分子檢測方法因操作簡單、特異、快速、靈敏，被廣泛應用。因此本研究采用PCR 方法對采集的咽拭子及病變明顯的關(guān)節(jié)滑液囊組織樣本共75 份進行檢測，PCR 陽性檢出率僅為41.33%，分析原因一方面在于部分樣品中MS 含量過低導致普通PCR 無法檢出，另一方面雖然在病理剖檢時觀察到腿部關(guān)節(jié)及胸部滑液囊有明顯的病變，PCR 卻未能檢測到MS，可能與檢測前已經(jīng)長時間用藥有關(guān)，雖然藥物對MS 已經(jīng)產(chǎn)生殺滅作用并清除了MS，但MS 對機體已經(jīng)造成了不可逆的損害，所以依然可見明顯的病變。有研究顯示，MS與多種病原有協(xié)同作用，如雞毒支原體、金黃色葡萄球菌、敗血性沙門氏菌、鏈球菌、大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒和傳染性喉氣管炎病毒等[13]，這些病原的混合或繼發(fā)感染，可導致MS 感染程度加重，同時也增加了MS 分離的難度。本研究未對上述病原進行鑒定，不能排除以上病原的感染或其與MS 的混合感染。

分離培養(yǎng)被認為是檢測MS 感染的“金標準”，但其費時費力，特別是在混合感染的情況下。一般情況下，MS 分離培養(yǎng)的陽性結(jié)果可在4 d～7 d 內(nèi)獲得，但陰性結(jié)果最多需要30 d[14]。本研究從31 份PCR 檢測陽性的樣本中僅分離出9 株MS，分離率僅為29.03%。分析分離率低的原因可能是因感染組織中病程過長等原因致使MS 活菌含量低，同時也有可能樣本在運輸保存過程中MS 已經(jīng)失活，最重要的原因可能是所選擇的培養(yǎng)基并不適合所有MS 的分離培養(yǎng)。有文獻報道，MS 生長過程中需要NAD等特殊生長因子[15]，同時采樣時或樣品中混合的其他對營養(yǎng)要求不高的細菌的生長會掩蓋MS 的生長，導致無法分離獲得MS[13]。因此，影響MS 分離的因素很多，通過分離鑒定MS 來達到診斷MS 感染的目的顯然不如PCR 方法，基于此，本研究先采用PCR 對臨床可疑樣本進行檢測，再有針對性地對PCR 陽性樣本進行MS 分離鑒定，本研究分離獲得9株MS 菌株，為進一步開展MS 病原學及免疫學相關(guān)研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

VlhA 基因是MS 的一個重要毒力基因，其編碼VlhA 蛋白，該蛋白由兩個可變的細胞表面蛋白組成，即可變脂蛋白（MSPB）和可變血凝素蛋白（MSPA），介導MS 粘附、侵襲和免疫逃避[16]。VlhA 基因具有很強的特異性，但其編碼的MSPB 和MSPA 均具有較高的抗原變異性，是目前MS 遺傳進化分析采用最多的靶基因[9,17]。本研究利用PCR 擴增獲得分離株VlhA基因目的片段，對其測序分析并繪制9 株分離株與GeneBank 登錄的MS 參考菌株的進化樹，結(jié)果兩株不同雞場來源的分離株SMU-SCYA-LF1/2019、SMUSCPS-LF2/2019 同源性僅89.8%，同源性不高，但其與中國分離株同屬一個分支，且與四川分離株KU572311.1 親緣關(guān)系最近；其余7 株分離自同一個雞場的分離株的同源性為96.4%～99.9%，同源性高，但與其他兩株不同雞場分離株以及四川和中國其他地區(qū)分離株存在較遠的遺傳距離，而與中東地區(qū)分離的3 株MS 親緣關(guān)系較近，應為新的川西地區(qū)流行株。川西部分地區(qū)肉雞場MS 分離株的獲得及其VlhA 基因遺傳進化分析揭示了川西部分地區(qū)肉雞場MS 的來源及其變異情況，為進一步開展MS 的病原生物學及免疫學相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。