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    山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231 侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制研究

    2020-06-01 01:03:56謝靜靜張金花金劍英郭群依
    關(guān)鍵詞:山茱萸存活率低劑量

    謝靜靜 張金花 金劍英 金 丹 郭群依

    全世界每年約有100 萬名婦女罹患乳腺癌,由于該病而死亡的人數(shù)超過37 萬[1-2]。雌激素可通過雌激素受體α(estrogen receptor α,ERα)與胰島素樣生長因子1 受體(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF-1R)途徑相互作用,繼而增加增殖,降低對細胞凋亡的敏感性[3-4]。IGF-1R/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinase,Akt)可以傳輸來自受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinase,RTK)和G 蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor,GPCRs)的信號,這些信號可被生長因子或細胞因子激活[5-6]。盡管RTK 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑重疊,IGF-1R 介導的活化Akt 特別有助于IGF-1R 的抗凋亡活性[7-8]。山茱萸提取物是屬于異黃酮類,包含許多可能抑制癌變的化合物,例如蛋白酶抑制劑、植酸、異黃酮;研究表明,山茱萸提取物的抗癌作用是由某些類型的細胞凋亡介導的,低濃度的山茱萸提取物可通過上調(diào)B 細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2),下調(diào)Bcl-2 相關(guān)的X(Bax)蛋白來促進凋亡,從而對MCF-7 細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用[9-10]。本研究擬探討山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231 侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制,為乳腺癌的治療提供理論依據(jù)。

    1 實驗材料

    1.1 材料 人乳腺癌細胞MDA-MB-231(美國典型培養(yǎng)物保藏中心,批號KTL-66792)。

    1.2 主要藥品及試劑 山茱萸提取物(陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司,批號190123);RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基(美國Life Technologies 公司,批號SJB-Q017、SKB-Q008);順鉑(德國默克公司,批號S5485);胰蛋白酶(武漢博士德生物工程有限公司,批號20181207);胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、無血清的Dulbecco's 改良的Eagle 培養(yǎng)基、硝酸纖維素膜(碧云天生物技術(shù)研究所,批號CT0507、CT0108、CT6074、CM5533);MTT 溶液(美國Sigma-Aldrich 公司,批號MR-781);二甲基亞砜(美國Origen Bioedical 公司,批號P60178);transwell 遷移室(德國Greiner 公司,批號DM-0079);基質(zhì)膠(美國BD 公司,批號P0873K);TRIzol 試劑(美國Invitrogen公司,批號IK5013);PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(寶生物工程大連有限公司,批號RR047A、RR0584);RIPA 緩沖液、蛋白酶、磷酸酶抑制劑、NuPAGE 轉(zhuǎn)移緩沖液(美國Sigma 公司,批號SA5466、SA0977、SA3011、SA7756);Bio-rad 蛋白質(zhì)測定染料試劑、NuPAGE Bis-Tris 凝膠、MOPS 運行緩沖液、5%脫脂乳TBS-T(賽默飛世爾科技有限公司,批號XY-2024R、XY-3077D、XT-5047、XA-0067);3%牛血清白蛋白(上海信裕生物科技有限公司,批號190201);兔抗人IGF-1R 單克隆抗體、兔抗人Akt 單克隆抗體、鼠抗人β-肌動蛋白(德國Millipore 公司,批號MAB5328、MAB1501、MAB4019);HRP 偶聯(lián)的二抗(美國Cell Signaling 公司,批號CS1123)。

    1.3 儀器 ELx800 酶標儀(美國BioTek Instuments 公司);奧林巴斯AI09 倒置光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司);Nikon Eclipse TS100 顯微鏡(日本Nikon 公司);ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)(美國ABI 公司);Pierce ECL 系統(tǒng)(美國通用公司)。

    2 實驗方法

    2.1 細胞培養(yǎng)及分組 將人乳腺癌細胞MDA-MB-231 分成四組,并在補充有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MDA-MB-231 細胞組:細胞濃度為5×106/mL 的人乳腺癌MDA-MB-231 細胞液在10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為:37℃、5%CO2、2%O2、93%N2;順鉑組:人乳腺癌MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)方法同人乳腺癌MDA-MB-231 細胞組,加入順鉑,使順鉑最終為100.0μg/mL(預(yù)試驗求出順鉑對乳腺癌細胞MDA-MB-231 的LC50 為200.0μg/mL,以1/2 LC50 為作用劑量);山茱萸提取物低、高劑量組的人乳腺癌MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)方法同前人乳腺癌MDA-MB-231 細胞組,各組分別加入山茱萸提取物,使山茱萸提取物最終為100.0、200.0μg/mL(預(yù)試驗求出山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231的LC50 為400.0μg/mL,以1/2 LC50 為高劑量水平,2 倍間距依次為低劑量水平)。以上各組每孔設(shè)6 個平行樣,培養(yǎng)72h。

    2.2 細胞活力及單克隆數(shù)目測定 為了進行細胞增殖測定,將細胞用0.25%胰蛋白酶消化,以1000 個細胞/孔的密度接種到96 孔板中,最終體積為100μL,并保持在補充有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中,將10μL MTT 溶液加入并將細胞在37°C 下再孵育4h。將藍色的甲基藍晶體溶于100μL 二甲基亞砜中,并使用ELx800 酶標儀在490nm 處測量吸光度(OD 值)。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)。

    用不同濃度的山茱萸提取物處理細胞72h 后,將細胞接種在6 孔板(500 個細胞/孔)中,每2~3 天用新鮮培養(yǎng)基更換。兩周后,棄去上清液,用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)小心洗滌細胞。隨后,將細胞用4%多聚甲醛固定15min(室溫下),然后在結(jié)晶紫中染色20min(室溫下)。通過數(shù)碼相機捕獲菌落的圖像。

    2.3 細胞遷移測定 使用刮擦傷口愈合試驗測定,將細胞以每孔2.5×105個細胞的量接種在6 孔板中,并在2 天之內(nèi)生長至匯合以形成單層,并在實驗前1天使血清饑餓。用200μL 移液器鈍頭在每個孔中進行一次刮擦,并將細胞培養(yǎng)基更改為1%FBS。在16h固定,并使用奧林巴斯AI09 倒置光學顯微鏡以×10放大倍數(shù)獲取圖像。

    2.4 細胞侵襲測定 使用transwell 遷移室進行細胞侵襲測定,將5×103細胞接種在涂有12.5μg 減少生長因子的基質(zhì)膠的8μm 多孔Transwell 插入片段的上腔中,在無血清的Dulbecco's 改良的Eagle 培養(yǎng)基中孵育。孵育后,將細胞用甲醇固定10min,并用2%結(jié)晶紫染色。用棉簽將未遷移的細胞從transwell 小室中移出。使用倒置的Nikon Eclipse TS100 顯微鏡對染色的Transwell 膜成像。

    2.5 細胞IGF-1R、Akt 基因表達測定 按照制造商的規(guī)程,使用TRIzol 試劑從細胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT 試劑盒將1μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后,按照制造商的操作規(guī)程,將1μL 互補DNA 用于隨后的qPCR 反應(yīng),所使用的試劑為SYBR Premix Ex Taq,使用的儀器為ABI 7500 實時PCR系統(tǒng)。本試驗所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,序列如下:IGF-1R 正向:5'-GGAGTTGTATTTGCCATCACCAGGG-3',反向:5'-ATGCGCGGGCAAATTTGATCCCATA-3';Akt 正向:5'-ACAAGCCACAAGATTACAAGAAACGG-3',反向:5'-CCACCAGAGTGAAAAGAACGATAGCT -3';GAPDH 正向:5'-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3',反向:5'-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3'。PCR 循環(huán)參數(shù)(30個循環(huán))如下:預(yù)變性(95°C,5min),變性(95°C,30s),退火(55°C,30s)和延伸(72°C,60s)。GAPDH 用作內(nèi)部對照。使用2-ΔΔCT 方法計算表達水平,并將其標準化為看家GAPDH 基因的表達水平。

    2.6 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達測定 根據(jù)試劑盒說明,用改良的RIPA 緩沖液裂解細胞,并加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑。離心細胞(13000rpm,10min,4℃),Bio-rad 蛋白質(zhì)測定染料試劑測量蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)樣品(10μg)裝入NuPAGE Bis-Tris 凝膠中,并使用MOPS 運行緩沖液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(80~120V,2h)。使用NuPAGE 轉(zhuǎn)移緩沖液將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用3%牛血清白蛋白封閉轉(zhuǎn)移膜1h。所有第一抗體為:兔抗人IGF-1R單克隆抗體、兔抗人Akt 單克隆抗體、鼠抗人β-肌動蛋白,在4℃下與膜孵育過夜。使用5%脫脂乳TBS-T 將HRP 偶聯(lián)的二抗抗體孵育1h。PBS 液洗滌3 次后,根據(jù)制造商的說明使用Pierce ECL 系統(tǒng)進行檢測信號。

    2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行錄入、統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差() 表示,采用單因素方差分析比較,多重比較采用LSD-t檢驗,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    3 結(jié)果

    3.1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率比較 與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率降低(P<0.05);與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組OD 值、存活率升高(P<0.05),山茱萸提取物高劑量組OD 值、存活率降低(P<0.05);與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)。見表1、圖1。

    圖1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖水平比較(結(jié)晶紫染色,×400)

    表1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率比較()

    表1 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞OD 值、存活率比較()

    注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑;山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物;山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物;與MDA-MB-231 細胞組比較,aP<0.05;與順鉑組比較,bP<0.05;與山茱萸提取物低劑量組比較,cP<0.05

    3.2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較 與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組克隆形成數(shù)目降低(P<0.05);與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組克隆形成數(shù)目升高(P<0.05),山茱萸提取物高劑量組克隆形成數(shù)目降低(P<0.05);與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組克隆形成數(shù)目降低(P<0.05)。見表2、圖2。

    圖2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色,×200)

    表2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較(個,)

    表2 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞克隆形成數(shù)目比較(個,)

    注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑;山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物;山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物;與MDA-MB-231 細胞組比較,aP<0.05;與順鉑組比較,bP<0.05;與山茱萸提取物低劑量組比較,cP<0.05

    3.3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力比較與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組遷移率降低(P<0.05);與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組遷移率升高(P<0.05),山茱萸提取物高劑量組遷移率降低(P<0.05);與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組遷移率降低(P<0.05)。見表3、圖3。

    圖3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移比較(×10)

    3.4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05);與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組穿膜數(shù)升高(P<0.05),山茱萸提取物高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05);與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05)。見表4、圖4。

    表3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力比較(%,)

    表3 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞遷移能力比較(%,)

    注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑;山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物;山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物;與MDA-MB-231 細胞組比較,aP<0.05;與順鉑組比較,bP<0.05;與山茱萸提取物低劑量組比較,cP<0.05

    圖4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞穿膜數(shù)數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色,×400)

    表4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較(個,)

    表4 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞侵襲能力比較(個,)

    注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑;山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物;山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物;與MDA-MB-231 細胞組比較,aP<0.05;與順鉑組比較,bP<0.05;與山茱萸提取物低劑量組比較,cP<0.05

    3.5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt mRNA 表達 與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組IGF-1R、Akt mRNA表達水平降低(P<0.05);與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組IGF-1R、Akt mRNA 表達水平升高(P<0.05),山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA表達水平降低(P<0.05);與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA表達水平降低(P<0.05)。見表5。

    3.6 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt蛋白表達 與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達降低(P<0.05);與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達升高(P<0.05),山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達降低(P<0.05);與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt 蛋白表達降低(P<0.05)。見表6、圖5。

    圖5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達的比較

    4 討論

    山茱萸提取物對多種類型的實體瘤具有顯著的抗癌活性,尤其是對轉(zhuǎn)移性乳腺癌和難治性卵巢癌的抗癌活性[11]。研究表明,高濃度的山茱萸提取物誘導人肝癌細胞G1 和G2/M 期的細胞周期停滯。此外高濃度的乳腺癌細胞會降低細胞周期蛋白D1 的表達[12]。本研究結(jié)果顯示,與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)降低;與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)升高,山茱萸提取物高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)降低;與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組OD 值、存活率、單克隆形成數(shù)目、遷移率、穿膜數(shù)降低。這與上述討論一致,同時說明山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDA-MB-231 增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用,200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤為明顯。

    表5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt mRNA表達比較()

    表5 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt mRNA表達比較()

    注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑;山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物;山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物;IGF-1R 為胰島素樣生長因子1 受體;Akt 為絲氨酸/蘇氨酸激酶;與MDA-MB-231 細胞組比較,aP<0.05;與順鉑組比較,bP<0.05;與山茱萸提取物低劑量組比較,cP<0.05

    表6 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達比較()

    表6 各組乳腺癌MDA-MB-231 細胞IGF-1R、Akt 蛋白表達比較()

    注:順鉑組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 順鉑;山茱萸提取物低劑量組為MDA-MB-231 細胞組+100.0μg/mL 山茱萸提取物;山茱萸提取物高劑量組為MDA-MB-231 細胞組+200.0μg/mL 山茱萸提取物;IGF-1R:胰島素樣生長因子1 受體;Akt:絲氨酸/蘇氨酸激酶;與MDA-MB-231 細胞組比較,aP<0.05;與順鉑組比較,bP<0.05;與山茱萸提取物低劑量組比較,cP<0.05

    IGF-1R 在各種癌癥的細胞生長、分化和進展中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報道,IGF-1R 在許多人類癌癥中都過表達,包括乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌,IGF-1R(IGF-1R 的一種配體)的高循環(huán)水平與多種類型癌癥的風險增加有關(guān),這主要取決于IGF-1/IGF-1R 下游信號的激活[13-14]。在被IGF-1 激活后,IGF-1R 的酪氨酸激酶活性使下游底物磷酸化,進而導致其下游信號通路的激活,包括磷脂酰肌醇3 激酶/RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信號級聯(lián)[15]。人乳腺癌中IGF-1R 的破壞導致IGF-1R 相關(guān)細胞增殖的抑制。配體誘導的IGF-1R 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化導致許多細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導分子(包括Akt 信號級聯(lián)反應(yīng))的活化[16]。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可通過失活促凋亡蛋白來促進細胞存活。已經(jīng)提出了許多通過激活A(yù)kt 信號來抑制細胞死亡的機制。因此,對IGF-1R 信號的干擾被認為是潛在的癌癥治療策略[17]。本次研究結(jié)果顯示,與MDA-MB-231 細胞組比較,順鉑組、山茱萸提取物低、高劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達降低;與順鉑組比較,山茱萸提取物低劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達升高,山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達降低;與山茱萸提取物低劑量組比較,山茱萸提取物高劑量組IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達降低。這說明,山茱萸提取物的濃度越高,IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白表達就越低,200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤為明顯,這提示山茱萸提取物可抑制IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白的表達進而抑制IGF-1R/Akt 信號通路的激活。

    綜上所述,山茱萸提取物對乳腺癌細胞MDAMB-231 增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用,200.0μg/mL 的山茱萸提取物效果尤為明顯;其機制可能與山茱萸提取物抑制IGF-1R、Akt mRNA 和蛋白的表達進而抑制IGF-1R/Akt 信號通路的激活有關(guān)。

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