混菌發(fā)酵鴨腿工藝優(yōu)化及其貯藏品質(zhì)特性

阮一凡，潘道東,，孫楊贏，田宏偉，湯曉艷

（1.寧波大學(xué) 浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315800；2.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315800；3.湖北周黑鴨企業(yè)發(fā)展有限公司，湖北 武漢 430040；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

肉類發(fā)酵自古以來就作為肉類的保存方式，最早的記錄可以追溯到公元前1 500年。隨著時(shí)間的推移，不同的地理區(qū)域開發(fā)出了不同大小、形狀、質(zhì)地、外觀和風(fēng)味的獨(dú)特肉類產(chǎn)品[1]。到19世紀(jì)中葉，人們認(rèn)識到細(xì)菌、酵母和霉菌在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的重要性，最終發(fā)酵過程才得到規(guī)范[2]?，F(xiàn)在的發(fā)酵肉制品是通過益生菌發(fā)酵得到的具有獨(dú)特風(fēng)味、營養(yǎng)價(jià)值高、易消化、具有保健功效的一類產(chǎn)品[3]，也因其具有水分活度低等優(yōu)勢，能很好地長期保藏。而且由于發(fā)酵肉制品中的微生物作用，能夠把營養(yǎng)物質(zhì)分解成小分子風(fēng)味物質(zhì)或者是易消化吸收的成分[4]。

鴨肉因其具有良好的口感和味道，廣受消費(fèi)者喜愛，同時(shí)鴨肉還具有低脂肪、低膽固醇等優(yōu)點(diǎn)，在當(dāng)今崇尚健康飲食消費(fèi)中備受歡迎[5]。添加發(fā)酵劑與肉制品中，可以起到抑制有害菌生長、縮短生產(chǎn)周期、改善產(chǎn)品色澤及風(fēng)味的作用，從而實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[6]。國內(nèi)外已有將發(fā)酵劑應(yīng)用于食品提升產(chǎn)品品質(zhì)的研究。張洵[7]使用植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和釀酒酵母菌改良發(fā)酵魚糜，得到的產(chǎn)品具有良好的理化性質(zhì)、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味；Palavecino等[8]用清酒乳桿菌分別與小牛葡萄球菌和木糖葡萄球菌混合，制作出兩組香腸進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組香腸的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值都不同程度顯著低于未接菌組。說明選擇正確的發(fā)酵劑添加到肉中，會對肉的感官風(fēng)味品質(zhì)、安全性能等都有很大的幫助。

發(fā)酵肉制品在貯藏過程中，由于受到原料質(zhì)量、pH值、微生物、酶、溫度、濕度和時(shí)間等因素的影響，也存在一些潛在的安全隱患，比如亞硝酸鹽和生物胺的積累，在適宜條件下會形成致癌物亞硝基化合物[9]；雖然脂肪氧化有益于風(fēng)味的產(chǎn)生，但是過度的氧化會產(chǎn)生毒素，危害人體健康，而且一般發(fā)酵肉制品都具有較高的脂肪含量，所以也極易發(fā)生脂肪過度氧化[10]；最后還有病原菌和霉菌毒素的產(chǎn)生等[11]，它們既會影響產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，更重要的是會危害到人體健康。譚李紅等[12]研究發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌和木糖葡萄球菌復(fù)合發(fā)酵能夠降低發(fā)酵香腸中生物胺含量；胡永金[13]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物乳桿菌、木糖葡萄球菌和干酪乳桿菌接種比例為1∶1∶1時(shí)，加入魚糜中可有效抑制腸道菌等雜菌及致病菌的生長繁殖，降低生物胺和揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）累積，提高發(fā)酵制品的生物安全性。所以發(fā)酵劑的使用可以有效延長發(fā)酵肉制品的貯藏期，提高安全品質(zhì)。

本研究以鴨腿肉為原料，通過對接菌量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行發(fā)酵鴨腿的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定其最佳工藝配比，并對終產(chǎn)品的大腸桿菌、過氧化值、亞硝酸鹽和組胺含量進(jìn)行測定，確定其安全性。然后對發(fā)酵鴨腿成品貯藏過程中感官評價(jià)、菌落總數(shù)、亞硝酸鹽含量、TBARS值、TVB-N值及生物胺的變化進(jìn)行測定，以期為發(fā)酵鴨腿產(chǎn)品貯藏品質(zhì)變化提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃谷鴨腿、香辛料及輔料為當(dāng)?shù)厥惺郏恢参锶闂U菌、釀酒酵母菌為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

亞硝酸鹽、抗壞血酸、葡萄糖（均為食品級）寧波航景生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；丹磺酰氯、色胺、苯乙胺等生物胺標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲醇、乙腈、丙酮均為色譜純；氯仿、高氯酸、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氨水等均為分析純；真空包裝袋（70 mm×100 mm，厚度0.08 mm） 中國廣東佛山市雙福包裝有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite 200 pro全波長掃描多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 江蘇蘇州凈化設(shè)制有限公司；QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；H1850R冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HSW型智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 浙江寧波江南儀器廠；XHF-D高速分散器 浙江寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵鴨腿的制作工藝

1.3.1.1 發(fā)酵劑制備

活化好的植物乳桿菌取1%接入MRS肉湯中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h；釀酒酵母菌接種環(huán)挑出單菌落，接入YPD培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后，取出菌液按所需比例混合，8 000 r/min、4 ℃高速冷凍離心10 min后用無菌生理鹽水洗滌，重復(fù)3 次，收集菌體，最后用無菌生理鹽水稀釋得到所需液體發(fā)酵劑。

1.3.1.2 生產(chǎn)配方

參考王萍萍等[14]方法，稍作修改。按1 kg肉質(zhì)量計(jì)，食鹽1.5%，亞硝酸鈉0.010%，抗壞血酸0.08%，蔗糖1.5%，葡萄糖1%，味精0.2%，白胡椒粉0.08%，料酒4.0%，花椒0.15%，洋蔥粉0.2%，生抽6.5%。

1.3.1.3 工藝流程及主要步驟

工藝流程：原料鴨腿→腌制料→4 ℃、24 h冷藏腌制→添加發(fā)酵劑→發(fā)酵→煮制→真空包裝→殺菌→成品。

步驟：原料鴨腿：從市場挑選剛宰后新鮮鴨腿（均質(zhì)量約為250 g），洗凈血水，用刀背輕敲并且割開幾個(gè)小口，方便調(diào)料入味；腌制：按1.3.1.2節(jié)配方依次加入輔料與肉混勻，于4 ℃冷藏腌制24 h；添加發(fā)酵劑：將接種量為106CFU/g的發(fā)酵劑與腌制好的肉混勻；發(fā)酵：將混勻好的鴨腿吊掛在恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，在一定的發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間條件下，相對濕度50%；蒸制：將發(fā)酵好的鴨腿于沸水上方蒸制30～35 min，即得到發(fā)酵鴨腿成品；包裝：待冷卻后進(jìn)行真空包裝；貯藏：成品于常溫（20 ℃左右）貯藏。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 接菌量對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

接菌量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，菌種配比1∶1的植物乳桿菌-釀酒酵母菌加入肉料中，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h。測定成品的感官評分和pH值。

1.3.2.2 發(fā)酵劑菌種配比對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

接菌量選取1.3.2.1節(jié)最佳條件，植物乳桿菌-釀酒酵母菌菌種配比分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶3、3∶2、2∶1進(jìn)行接種，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h。測定成品的感官評分和pH值。

1.3.2.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

接菌量選取1.3.2.1節(jié)最佳條件，植物乳桿菌-釀酒酵母菌菌種配比選取1.3.2.2節(jié)最佳條件加入肉料中，發(fā)酵溫度分別為24、27、30、33、36、39 ℃，發(fā)酵時(shí)間18 h。測定成品的感官評分和pH值。

1.3.2.4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響

接菌量、發(fā)酵劑菌種配比和發(fā)酵溫度均選取上述最優(yōu)條件，發(fā)酵時(shí)間分別為6、12、18、24、30、36 h。測定成品的感官評分和pH值。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以感官評分和pH值為檢測指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 感官評定

邀請10 名消費(fèi)者（固定）參照GB 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》[15]，對發(fā)酵鴨腿產(chǎn)品的顏色、黏度、彈性、氣味進(jìn)行評價(jià)，以能否檢測出感官的不可接受為最低標(biāo)準(zhǔn)，確定產(chǎn)品感官可接受性。感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

1.3.5 pH值的測定

參照Aro等[16]的方法，略有修改。取10 g樣品剪碎，加入90 mL蒸餾水，勻漿6×10 s，過濾，用pH計(jì)測定濾液的pH值。

1.3.6 終產(chǎn)品理化指標(biāo)測定

1.3.6.1 大腸桿菌的測定

參照GB 4789.38—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》[17]方法進(jìn)行測定。

1.3.6.2 亞硝酸鹽的測定

按南京建成生物研究所試劑盒的方法進(jìn)行測定。

1.3.6.3 過氧化值的測定

參照GB/T 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》[18]方法進(jìn)行測定。

1.3.6.4 組胺的測定

參考白婷[4]的方法進(jìn)行測定：超聲處理（功率300 W，溫度45 ℃）2 min，6 000 r/min離心5 min。取1.0 mL鹽酸提取液，置于10 mL離心管中，再加入1 mL水后加氫氧化鈉溶液呈堿性；后續(xù)方法采用GB/T 5009.45—2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》[19]進(jìn)行測定。

1.3.7 貯藏期指標(biāo)測定

1.3.7.1 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[20]的方法進(jìn)行測定。

1.3.7.2 TBARS值的測定

參照Witte等[21]的方法，略有修改。取10 g鴨腿肉絞碎，向里加入50 mL 7.5%的三氯乙酸（含0.1%乙二胺四乙酸），在冰浴中以10 000 r/min勻漿6×10 s，然后過濾。取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mo1/L TBARS溶液，于沸水浴中保溫40 min，取出冷卻后再以5 000 r/min離心5 min，上清液取出后加入等體積氯仿混勻，靜置分層后，吸取上層清液，分別測定在532 nm和600 nm波長處的吸光度（A），并按下式計(jì)算TBARS值：

1.3.7.3 TVB-N值的測定

參考GB/T 5009.44—2003[15]的方法對各組鴨肉樣品中的TVB-N含量進(jìn)行測定。

1.3.7.4 生物胺的測定

參照Tasi?等[22]和朱志遠(yuǎn)[23]的方法，并稍作修改。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺標(biāo)準(zhǔn)品制成1 mg/mL儲備液備用。用0.4 mol/L高氯酸溶液將以上標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配成終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。鋁箔避光、-20 ℃冰箱保存。

樣品處理：取5 g絞碎肉樣加入20 mL的0.4 mol/L高氯酸溶液，冰浴勻漿，5 000 r/min、4 ℃離心10 min取上清液，沉淀用上述方法再提取1 次。合并2 次提取的上清液用0.4 mol/L高氯酸溶液定容到50 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的衍生化：取1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液使之呈堿性，接著加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后加入2 mL的丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為色譜級丙酮，現(xiàn)配現(xiàn)用），于40 ℃水浴中暗以應(yīng)處理30 min后加入100 μL的氨水中止以應(yīng)，去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容至5 mL，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，用于分析檢測。取1 mL的樣液如標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行柱前衍生。

色譜條件：Agilent ZORBAX XDB-C18以相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，紫外檢測波長254 nm；流動相：水（A相）、乙腈（B相）、0.1 mol/L乙酸銨（C相）；洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差及顯著性分析（Duncan多重比較），統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平設(shè)定為0.05，用Origin 8.1軟件作圖，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 接菌量的選擇

圖1 接菌量對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 1 Effect of inoculum amount on the quality of fermented duck thigh

由圖1可看出，隨著接菌量的增加，發(fā)酵鴨腿的感官評分值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，pH值則逐漸下降，在接菌量2%和2.5%時(shí)差異不顯著（P＞0.05）。在接菌量為2%時(shí)，達(dá)到最大值82 分。原因可能是隨著發(fā)酵劑的量增多，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味化合物增多，使發(fā)酵鴨腿口感品質(zhì)較好。但添加過多的發(fā)酵劑后，其發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)物，比如乳酸產(chǎn)生過多，導(dǎo)致產(chǎn)品pH值過低，影響產(chǎn)品接受度。綜合感官評分和pH值，選擇接菌量2%為最適條件。

2.1.2 發(fā)酵劑菌種配比的選擇

圖2 菌種配比對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 2 Effect of inoculum composition on the quality of fermented duck thigh

由圖2可知，當(dāng)植物乳桿菌比例不變，隨著釀酒酵母菌比例的增加，感官評分變化不顯著，pH值逐漸上升。當(dāng)比例為2∶3時(shí)，感官評分最高為83 分，說明植物乳桿菌對于感官評分的影響較大，而此時(shí)產(chǎn)品pH值為5.27。而當(dāng)比例為3∶2時(shí)，感官評分下降，可能是因?yàn)槿樗峋^多，產(chǎn)生乳酸降低了pH值，影響口感，而此時(shí)pH值最低為4.75。所以選擇菌種配比2∶3為最佳。

2.1.3 發(fā)酵溫度的選擇

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented duck thigh

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵鴨腿的感官評分呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，pH值逐漸降低，因?yàn)闇囟仍礁?，發(fā)酵會越快，pH值降低越顯著。隨著溫度緩慢升高，感官評分的變化不顯著，當(dāng)溫度在33 ℃時(shí)達(dá)到最大，然后開始下降，可能是因?yàn)榘l(fā)酵溫度升高，加速了脂肪的氧化，油脂味重影響口感。所以選取發(fā)酵溫度33 ℃為最適條件。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的選擇

圖4 發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵鴨腿品質(zhì)的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on the quality of fermented duck thigh

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長，前期感官評分上升趨勢快，在12～18 h期間差異不顯著，而后在第24小時(shí)感官評分達(dá)到最大值，然后隨著時(shí)間的延長緩慢下降，差異不顯著。而pH值在6～12 h和18～24 h差異不顯著（P＞0.05），后期隨著時(shí)間的延長則逐漸減少?？赡艿脑蚴乔捌诎l(fā)酵時(shí)間太短導(dǎo)致發(fā)酵不徹底，沒有形成很好的風(fēng)味。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，乳酸菌與酵母菌相互作用，產(chǎn)生良好的風(fēng)味物質(zhì)。但時(shí)間過長也可能造成乳酸的積累導(dǎo)致風(fēng)味不佳，后續(xù)感官評分逐漸下降。所以，選取發(fā)酵時(shí)間24 h為最適條件。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Minitab17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以菌種配比（A）、發(fā)酵溫度（B）、接菌量（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）作為4 個(gè)考察因素，選取3 個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)并對結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳工藝條件。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design in terms of coded and actual data with experimental results

由表3可知，感官評分最優(yōu)水平為A3B2C3D2；而低pH值有利于產(chǎn)品保存，所以最優(yōu)水平為A3B2C3D3。感官評分4 個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋航泳浚–）＞發(fā)酵溫度（B）＞菌種配比（A）＞發(fā)酵時(shí)間（D），說明接菌量作用最大；而pH值4 個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋航泳浚–）＞發(fā)酵溫度（B）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞菌種配比（A），也說明混合發(fā)酵劑的接菌量直接影響產(chǎn)品的pH值。選擇表3中感官評分最高和pH值較小的A2B2C3D1與上述A3B2C3D2和A3B2C3D3進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表4所示。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of validation experiments

由表4可知，A3B2C3D2感官評分最高，但與A2B2C3D1的差異不顯著（P＞0.05），而A2B2C3D1組的pH值雖高于A3B2C3D3，但高質(zhì)量發(fā)酵產(chǎn)品pH值應(yīng)控制在4.7～5.2之間[4]，此時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)品既有利于產(chǎn)品保存，又不會因?yàn)檫^酸影響口感。所以最后確定A2B2C3D1為最優(yōu)工藝組合，即菌種（植物乳桿菌-釀酒酵母菌）配比1∶2、發(fā)酵溫度30 ℃、接菌量2.0%、發(fā)酵時(shí)間24 h。

2.3 發(fā)酵鴨腿理化指標(biāo)測定結(jié)果

表5 發(fā)酵鴨腿理化指標(biāo)Table 5 Physicochemical indicators of fermented duck thigh

pH值是發(fā)酵肉制品的一個(gè)重要指標(biāo)，高質(zhì)量的發(fā)酵產(chǎn)品pH值應(yīng)控制在4.7～5.2之間[4]。此時(shí)的產(chǎn)品才能達(dá)到抑制腐敗菌生長，改善產(chǎn)品色澤、質(zhì)構(gòu)，降低亞硝酸鹽殘留量的效果，從而保證產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量穩(wěn)定性[24]。由表5可知，此時(shí)接菌發(fā)酵的產(chǎn)品pH值為5.02，既滿足了消費(fèi)者對酸度的接受范圍，也對產(chǎn)品的安全性有了保障。大腸桿菌作為判斷發(fā)酵香腸安全性的重要指標(biāo)之一，根據(jù)國家對發(fā)酵肉制品的要求是小于30 MPN/100 g，終產(chǎn)品中未檢出大腸桿菌，因?yàn)榘l(fā)酵劑特別是乳酸菌的生長可以抑制致病菌的生成。過氧化值直接以映了脂肪氧化的程度，乳酸菌會生成乳酸從而降低pH值，當(dāng)pH值小于7時(shí)，脂肪氧化的程度會隨著pH值的升高而增強(qiáng)[25]，所以終產(chǎn)品脂肪氧化程度低。亞硝酸鹽作為腌制劑添加到肉中，但乳酸菌可以一定程度促進(jìn)亞硝酸鹽分解，降低其含量。組胺作為毒性最強(qiáng)的生物胺，一直在發(fā)酵肉制品中備受關(guān)注，因?yàn)榘l(fā)酵肉制品的蛋白含量普遍較高，隨著加工和貯藏時(shí)間的延長，容易生成生物胺。由于發(fā)酵時(shí)間短，產(chǎn)品組胺沒有檢出。

2.4 貯藏期指標(biāo)測定結(jié)果

2.4.1 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中菌落總數(shù)的變化

菌落總數(shù)測定用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，以映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價(jià)[26]。根據(jù)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：一級鮮肉，細(xì)菌總數(shù)≤104CFU/g；二級鮮肉，細(xì)菌總數(shù)≤106CFU/g；三級鮮肉，細(xì)菌總數(shù)≤107CFU/g；腐敗肉，細(xì)菌總數(shù)＞108CFU/g。

圖5 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中菌落總數(shù)的變化Fig. 5 Changes in total plate count during storage of fermented duck thigh

由圖5可知，貯藏初期接菌組菌落總數(shù)為3.46（lg（CFU/g）），且接菌組數(shù)量明顯高于對照組，這可能是因?yàn)橥匀话l(fā)酵相比，接種的發(fā)酵劑中含有植物乳桿菌及釀酒酵母菌。接菌組鴨腿的菌落總數(shù)在貯藏過程中呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，從第0天的3.46（lg（CFU/g））上升到第20天的4.42（lg（CFU/g）），之后開始下降，到第50天為3.22（lg（CFU/g）），且40 d和50 d沒有顯著差異，可能是間隔時(shí)間短，菌落總數(shù)變化量不大。

貯藏初期，乳酸菌可以在真空環(huán)境中生長并可耐鹽，逐漸成為優(yōu)勢菌群，成為平板菌落計(jì)數(shù)中的主要組成[27]。隨著時(shí)間的延長，微生物彼此的競爭作用以及營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，導(dǎo)致微生物的生長繁殖受到抑制，表現(xiàn)為菌落總數(shù)的減少[28]。據(jù)報(bào)道，貯藏后期乳酸菌對有害雜菌的抑制效果更顯著[29]。

2.4.2 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中感官評分的變化

圖6 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中感官評分的變化Fig. 6 Changes in sensory score during storage of fermented duck thigh

由圖6可知，第0天接菌組的感官評分為84.7，不接菌組的感官評分為79.66。在貯藏過程中接菌兩組發(fā)酵鴨腿的產(chǎn)品感官評分逐漸降低，但是接菌發(fā)酵組的評分一直高于不接菌組。而且不接菌組的發(fā)酵鴨腿在第20天時(shí)感官評分為61.71，在第30天已經(jīng)低于60 分，鴨肉已經(jīng)散發(fā)出不好的腐敗氣味，從菌落總數(shù)指標(biāo)也可以看出，在第30天時(shí)，不接菌組的菌落總數(shù)已經(jīng)大于106CFU/g，所以這種不好聞的氣息可能來源于微生物引起的質(zhì)量劣變，影響了感官評分，后續(xù)沒有對不接菌的鴨腿進(jìn)行感官的評分。而接菌組在第50天感官評分仍為67.54。

2.4.3 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中亞硝酸鹽的變化

圖7 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig. 7 Changes in nitrite content during storage of fermented duck thigh

如圖7所示，在貯藏期間發(fā)酵鴨腿的亞硝酸鹽含量在第20天達(dá)到最大值，隨后逐漸減少。而不接菌發(fā)酵鴨腿在貯藏過程中持續(xù)增加，但50 d內(nèi)亞硝酸鹽含量始終低于30 mg/kg，符合GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。

在常溫下，微生物活動活躍，以引起食物腐敗的G+細(xì)胞（如肉毒核狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等）腐敗菌繁殖加快，產(chǎn)生毒素導(dǎo)致蛋白質(zhì)易分解，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生大量的胺類物質(zhì)。此時(shí)形成的亞硝胺數(shù)量更多，從而不接菌組的亞硝酸鹽含量會持續(xù)增加[30]。而接菌組中的乳桿菌逐漸成為優(yōu)勢菌群從而抑制腐敗菌的生成，所以會抑制亞硝酸鹽的生成。

2.4.4 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TBARS值的變化

TBARS值越大，脂肪氧化的程度越高，產(chǎn)生的小分子物質(zhì)如酮、醛、酸類等物質(zhì)越多，因而產(chǎn)品的腐敗越嚴(yán)重[31]。產(chǎn)品中TBARS值在0.5～1.0 mg/kg時(shí)不會產(chǎn)生腐敗氣味，小于1.0 mg/kg的產(chǎn)品是可以接受的[32]。據(jù)報(bào)道[33]，TBARS值達(dá)到1～2 mg/kg以上就已腐敗變質(zhì)。

圖8 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TBARS值的變化Fig. 8 Changes in thiobarbituric acid content during storage of fermented duck thigh

由圖8可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，接菌組發(fā)酵鴨腿的TBARS值從初始的0.49 mg/kg逐漸增加至第50天的0.63 mg/kg，增長的幅度較小，可能是真空環(huán)境以及發(fā)酵鴨腿在制作過程中使用亞硝酸鹽、異抗壞血酸鈉和發(fā)酵劑的共同作用。而且因?yàn)橹参锶闂U菌可以產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致pH值的下降，抑制脂肪的氧化，所以接菌處理對TBARS具有抑制作用。與本實(shí)驗(yàn)相似的研究結(jié)果也表明，成熟風(fēng)干香腸在長期真空貯藏（7 個(gè)月）期間，TBARS值只略有上升[34]。而不接菌組從初始的0.65 mg/kg到1.27 mg/kg，在第30天的含量已經(jīng)高達(dá)0.85 mg/kg，說明接種發(fā)酵劑可顯著影響并延緩發(fā)酵鴨腿的脂質(zhì)氧化。

2.4.5 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TVB-N值的變化

肉品中TVB-N值隨著貯藏時(shí)間的延長而增高[35]。TVB-N值小于15 mg/100 g為一級鮮度，在15～20 mg/100 g之間為二級鮮度，大于20 mg/100 g為變質(zhì)肉[36]。

圖9 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中TVB-N值的變化Fig. 9 Changes in TVB-N content during storage of fermented duck thigh

由圖9可知，接菌組發(fā)酵鴨腿TVB-N值從初始2.61 mg/100 g到50 d的14.98 mg/100 g，不接菌組從初始的2.30 mg/100 g到50 d的34.02 mg/100 g，TVB-N值在整個(gè)貯藏過程中持續(xù)增加，但接菌組中TVB-N值增加緩慢，且都低于15 mg/100 g。結(jié)果表明，接種混合發(fā)酵劑可有效抑制TVB-N的生成，提高發(fā)酵香腸的衛(wèi)生質(zhì)量。與Yang等[37]結(jié)果相似。同時(shí)Talon等[38]也發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過降低pH值抑制雜菌和致病菌的生長，阻止雜菌利用游離氨基酸等含氮化合物產(chǎn)生揮發(fā)性含氮成分。

2.4.6 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中生物胺含量的變化

在貯藏的前期，接菌組的生物胺含量大多高于不接菌組，這可能是因?yàn)樯锇肥窃谖⑸镒饔孟掠捎坞x氨基酸作為前體物合成的，而且游離氨基酸作為營養(yǎng)物可促進(jìn)微生物生長，其中就有生物胺形成菌，這些菌能直接加快生物胺的積累[39]。因此，游離氨基酸的存在與生物胺的積累呈正相關(guān)，這與之前游離氨基酸的測定結(jié)果吻合[4]。生物胺混標(biāo)色譜見圖10。

圖10 生物胺混標(biāo)色譜圖Fig. 10 Chromatograms of mixed standard solution of biogenic amines

美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定食品中生物胺總量不得超過1 000 mg/kg，其中組胺含量≤50 mg/kg，酪胺含量≤100 mg/kg[40]。如表6所示，除尸胺外，其他接菌組的生物胺都是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而不接菌組的生物胺含量一直呈現(xiàn)出上升趨勢。通過發(fā)酵為生物胺的形成創(chuàng)造了適當(dāng)條件，包括微生物生長和蛋白質(zhì)水解。在貯藏前期，微生物的存在及發(fā)酵產(chǎn)品成熟過程中微生物脫羧酶的殘留活性，水解形成的游離氨基酸作為胺的潛在前體，都會增加生物胺含量[34]。從圖5可以看出，從30 d開始菌落總數(shù)開始下降，有研究表明，生物胺的減少可能與微生物數(shù)量的減少有關(guān)，尤其是乳酸菌含量[41]，所以證明貯藏后期生物胺含量的下降。細(xì)菌在貯藏期間的生長受到貯藏溫度、含氧量、氯化鈉含量等的影響。而由于大部分與組胺產(chǎn)生有關(guān)的細(xì)菌為嗜溫菌[42]，所以前期沒有組胺產(chǎn)生，而后期產(chǎn)生可能是因?yàn)槭覝叵陆M胺易形成[4]。而接菌組的生成組胺含量少于不接菌組，說明混菌發(fā)酵可以有效控制發(fā)酵肉中組胺的積累，這也與Tsai等[43]的結(jié)論相似。

表6 發(fā)酵鴨腿貯藏過程中各生物胺的含量Table 6 Changes in biogenic amines contents during storage of fermented duck thighmg/kg

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，引入新的發(fā)酵工藝制備發(fā)酵鴨腿，并研究其品質(zhì)特性的變化規(guī)律，得到的發(fā)酵鴨腿產(chǎn)品發(fā)酵風(fēng)味濃郁，品質(zhì)良好。通過對接菌量、菌種配比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間這4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到發(fā)酵鴨腿的最佳工藝條件為接菌量2%、植物乳桿菌-釀酒酵母菌菌種配比1∶2、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h，通過對此工藝下制作的發(fā)酵產(chǎn)品pH值、大腸桿菌、亞硝酸鹽、組胺和過氧化值測定，得到產(chǎn)品的指標(biāo)均在國家標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)，說明此工藝條件下制得的發(fā)酵鴨腿具有較高的感官評分和較好的安全性。在常溫貯藏過程中，真空包裝的發(fā)酵鴨腿其菌落總數(shù)和亞硝酸鹽含量呈先增加后降低的趨勢，TBARS值和TVB-N值始終在緩慢增加，整體的變化范圍較小。酪胺、精胺與腐胺是貯藏期間檢出的主要胺類物質(zhì)，接菌組生物胺含量在貯藏期間的后期有所下降，不接菌組生物胺含量初期較低，后期持續(xù)升高。不接菌組于30 d因微生物質(zhì)量劣變引起不好的風(fēng)味，而接菌組將產(chǎn)品貯藏期延長至50 d。所以添加混合發(fā)酵劑能夠提升產(chǎn)品口感和延長產(chǎn)品貯藏期，為新型發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了新的方向和理論指導(dǎo)。