黃芪生脈飲中多糖水解單糖指紋圖譜的研究

侯曉蓉，任立琴，裘飛君2，王鵬飛，章 旋，占扎君，單偉光

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江新光藥業(yè)股份有限公司，浙江 紹興 312000)

多糖(polysaccharide)，由10個及以上的單糖分子通過脫水形成糖苷鍵連接而成的含醛基或羰基的多羥基聚合物[1]，因其具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗炎、抗凝血[4]等多種生物活性而受到了廣泛的關(guān)注。據(jù)現(xiàn)代藥理研究，黃芪含有多糖、膽堿、皂苷、氨基酸、甜菜堿、香豆素及黃酮等[5-6]。其中，黃芪多糖[7-9]可有效對抗異丙腎上腺素導(dǎo)致的心肌缺血大鼠的心電圖ST-T段的異常變化，降低血漿乳酸脫氫酶、肌酸激酶活力，增加心肌組織過氧化氫酶和超氧物歧化酶的活力，并可減少丙二醛生成，減輕心肌細(xì)胞的形態(tài)變化，從而減少心肌缺血造成的損傷[10]。生脈飲[11]始見于唐·孫思邈《千金要方》，具有益氣滋陰、斂汗生津之功，被歷代醫(yī)家廣泛用于臨床。因此，在生脈飲基礎(chǔ)上加黃芪一味得黃芪生脈飲，黃芪生脈飲因其益氣滋陰，養(yǎng)心補(bǔ)肺的療效，越來越多地被用于氣陰兩虛、心悸氣短的冠心病患者身上[12-13]。目前，對黃芪生脈飲中多糖的研究較少，關(guān)于其指紋圖譜的建立未見報道，因此，筆者對黃芪生脈飲中的多糖進(jìn)行水解及衍生化，并建立黃芪生脈飲多糖高效液相色譜指紋圖譜，旨在較為全面地反映黃芪生脈飲中多糖水解單糖的種類與數(shù)量，進(jìn)而對其質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評價，對其質(zhì)量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 儀 器

Agilent高效液相色譜儀(美國安捷倫有限公司，1260Ⅱ)，XS205十萬分之一天平(METTLER TOLEDO，XS205DU)，電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司，DF-101S)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司，SB-1200)，冷凍干燥劑(北京博伊康實驗儀器有限公司，F(xiàn)D-1D-50)，離心機(jī)(上海安亭儀器科學(xué)廠，TGL-16G)。

1.1.2 材料與試劑

材料：黃芪生脈飲由新光藥業(yè)股份有限公司提供，批號分別為20140208，20140516，20140909，20150114，20150804，20151114，20160712，20170704，20171111，20180704。

試劑：三氟乙酸(TFA，分析純，麥克林試劑有限公司)，三氯甲烷(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)，無水乙醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，單糖對照品為D-甘露糖(Man)、D-核糖(Rib)、L-鼠李糖(Rha)、D-半乳糖(Gal)、D-木糖(Xyl)、D-阿拉伯糖(Ara)、L-巖藻糖(Fuc)、D-葡萄糖(Glu)、D-半乳糖醛酸(GalA)、D-葡萄糖醛酸(GluA)(分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)，乙腈(色譜純，美國天地試劑公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖樣品水解

精確量取100 mL黃芪生脈飲口服液進(jìn)行減壓濃縮，得浸膏狀黃芪生脈飲，加入20 mL蒸餾水進(jìn)行復(fù)溶，再加入80 mL無水乙醇得到80%的黃芪生脈飲醇溶液，于4 ℃條件下靜置過夜。靜置后的醇溶液于高速離心機(jī)中4 ℃下3 000 r/min離心15 min，離心結(jié)束后棄去上清液，對沉淀部分進(jìn)行減壓濃縮以去除多余乙醇，冷凍干燥后得黃芪生脈飲總多糖樣品。

精確稱取黃芪生脈飲總多糖樣品5.0 mg于耐壓瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸2.0 mL，120 ℃油浴水解6 h。冷卻后向水解液中加入適量甲醇，旋蒸濃縮至干，以去除多余三氟乙酸，重復(fù)3 次，加入1 mL蒸餾水溶解后用于PMP(1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮)柱前衍生化。

1.2.2 PMP衍生化方法

1) 單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生化

分別取400 μL單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(2 mmol/L)，加入400 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液和400 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，混合均勻，在70 ℃ 水浴鍋中反應(yīng)80 min，冷卻至室溫，加入500 μL 0.3 mol/L的HCl溶液進(jìn)行中和，加蒸餾水300 μL，再加入等體積氯仿萃取3 次，取上層水相，用0.45 μm微孔膜過濾，待HPLC分析；取400 μL的混合單糖對照樣品溶液(2 mmol/L)，同法制備混合單糖樣品PMP衍生物。

2) 樣品衍生化

取400 μL多糖水解單糖溶液，對其進(jìn)行衍生化，方法同上。

1.2.3 高效液相色譜分析條件

色譜條件為：流速0.8 mL/min，檢測波長250 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動相為V(0.1 mol/L 磷酸緩沖鹽)∶V(乙腈)=83∶17，等度洗脫。

1) 色譜柱的選擇

對幾種常用的色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)以出峰時間及各峰之間分離度分別進(jìn)行考察。

2) 流動相的選擇

流動相中有機(jī)相種類及比例的選擇：考察不同的乙腈比例下，各色譜峰的出峰時間及分離度情況，選擇合適的等度洗脫比例；流動相中緩沖鹽pH的選擇：通過改變緩沖鹽中Na2HPO4溶液與NaH2PO4溶液的配比，分別得到pH為6.6，6.8，7.0的3 個不同pH的緩沖溶液，觀察不同pH下混合單糖對照品中各色譜峰出峰情況及各色譜峰之間分離度情況。

1.2.4 方法學(xué)考察

1) 儀器精密度考察

取衍生化反應(yīng)后的同一批供試品溶液(批號S1)，連續(xù)進(jìn)樣6 次，考察相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

2) 重復(fù)性考察

取衍生化反應(yīng)后的供試品溶液6 份(批號S1～S6)分析，考察相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

3) 穩(wěn)定性考察

取衍生化反應(yīng)后的同一批供試品溶液(批號S1)，分別于0，2，4，6，10，24 h進(jìn)樣，考察相對峰面積的RSD值。

1.2.5 樣品測定

制備10批次黃芪生脈飲樣品(S1～S10)的供試品溶液，得到其液相色譜圖，采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件對樣品中多糖水解單糖進(jìn)行相似度的評價分析。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 水解及衍生化條件優(yōu)化

2.1.1 水解條件篩選

分別考察不同TFA濃度(1，2，4，6 mol/L)對樣品水解程度的影響。按1.2.2節(jié)方法制備供試品溶液，水解所用供試品溶液各10 μL，按1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析。

現(xiàn)有的HPLC單糖組成分析方法一般先對樣品進(jìn)行水解處理，然后進(jìn)行PMP柱前衍生化過程。水解使用的TFA濃度與樣品水解程度有直接關(guān)系。由圖1可知：隨著水解所用TFA濃度的升高，共有峰的峰面積之和呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在TFA濃度低于2 mol/L時，色譜圖中各主要色譜峰的共有峰面積之和較小，可能是由于樣品水解不夠完全；隨著TFA濃度的升高，峰面積之和開始升高，當(dāng)TFA濃度達(dá)到2 mol/L時，峰面積之和達(dá)到最大值，隨后開始下降，最后基本沒有變化，可能是因為TFA具有強(qiáng)酸性，濃度過高容易導(dǎo)致樣品發(fā)生脫水反應(yīng)，從而導(dǎo)致樣品被破壞，水解后得到各單糖含量降低，各主要色譜峰的共有峰面積之和反而下降。因此水解樣品使用TFA濃度過高或者過低都無法準(zhǔn)確地對樣品中的各單糖組分含量進(jìn)行定量分析，最終確定水解時TFA濃度為2 mol/L。

圖1 不同TFA濃度水解對黃芪生脈飲多糖指紋圖譜共有峰面積之和的影響(n=3)Fig.1 Effect of different TFA concentration on the sum of common peak areas of HPLC fingerprint of polysaccharide hydrolyzed monosaccharide of HSD(n=3)

2.1.2 PMP衍生化條件篩選

1) PMP衍生化時間的篩選

在衍生化反應(yīng)的過程中，反應(yīng)時間會對衍生化反應(yīng)的程度產(chǎn)生較大影響。從圖2可知：隨著衍生化反應(yīng)時間的延長，主要共有特征峰的峰面積之和呈先升高后降低的趨勢。隨著衍生化反應(yīng)時間從30 min延長至100 min，共有峰面積和逐漸升高，當(dāng)衍生化反應(yīng)時間達(dá)到80 min時，各主要色譜峰的共有峰面積之和達(dá)到最大值，即可反應(yīng)完全。當(dāng)衍生化反應(yīng)時間超過80 min后，隨著反應(yīng)時間的繼續(xù)增加，各主要色譜峰的峰面積之和反而下降，說明在這種情況下，反應(yīng)時間的延長并不能有利于衍生化反應(yīng)的充分進(jìn)行，可能是由于過長的衍生化反應(yīng)時間導(dǎo)致了一些不明副產(chǎn)物的生成，從而導(dǎo)致各特征峰的共有峰面積之和下降。因此可確定衍生化最佳反應(yīng)時間為80 min。相比于已經(jīng)報道過的文獻(xiàn)[4]中衍生化時間為100 min，本實驗(80 min)減少了操作時間，提升了工作效率。

圖2 不同衍生化時間對黃芪生脈飲指紋圖譜共有峰面積之和的影響(n=3)Fig.2 Effect of different derivative time on the sum of common peak areas of HPLC fingerprint of polysaccharide hydrolyzed monosaccharide of HSD(n=3)

2) PMP衍生化試劑使用量的篩選

在衍生化反應(yīng)的過程中，衍生化試劑PMP的使用量同樣會對衍生化反應(yīng)的程度產(chǎn)生一定影響。由圖3可知：隨著衍生化試劑使用量的增加，主要共有特征峰的峰面積之和呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)衍生化試劑的使用量高于400 μL時，隨著PMP使用量的繼續(xù)增加，各主要色譜峰的峰面積之和反而下降，說明在這種情況下，PMP用量的增大影響了衍生化反應(yīng)的充分進(jìn)行，可能是由于過量的衍生化試劑導(dǎo)致反應(yīng)過程中副產(chǎn)物的生成，各特征峰的共有峰面積之和下降。因此可確定當(dāng)總多糖樣品為5.0 mg時，衍生化試劑PMP使用量為400 μL時衍生化反應(yīng)效果較好。傳統(tǒng)的衍生化反應(yīng)過程中[14]，通常使用過量的PMP，而強(qiáng)酸性溶液中含有堿性基團(tuán)的PMP，由于PMP的質(zhì)子化，很難在高效液相色譜分析之前被氯仿完全萃取。因此當(dāng)總多糖樣品為5.0 mg時，衍生化試劑PMP的使用量為400 μL不僅滿足所有衍生物峰面積之和最大，且檢測靈敏度最高，一定程度上減少了溶劑的使用量，符合現(xiàn)代綠色化學(xué)的理念。

圖3 衍生化試劑不同使用量對黃芪生脈飲指紋圖譜共有峰面積之和的影響(n=3)Fig.3 Effect of different PMP(2.0 mol/L) amount on the sum of common peak areas of HPLC fingerprint of polysaccharide hydrolyzed monosaccharide of HSD(n=3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

比較ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)等5個型號的色譜柱，篩選得到Ultimate XB-C18色譜柱下的色譜圖，不僅能夠達(dá)到基線分離的要求，且各峰之間基線平穩(wěn)，分離度均大于1.5，同等條件下其他色譜柱下色譜圖或者達(dá)不到所有單糖成分均出峰或者分離度不好，故本實驗分析項下的色譜柱均選用Ultimate XB-C18色譜柱。

2.2.2 流動相的優(yōu)化

1) 流動相比例的優(yōu)化

選擇0.1 mol/L磷酸緩沖鹽-乙腈作為流動相體系，通過改變有機(jī)相比例優(yōu)化分析方法。當(dāng)流動相中乙腈比例為19%時，部分峰之間無法達(dá)到基線分離；當(dāng)流動相中乙腈比例為15%時，部分峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)流動相中乙腈比例為17%時，各色譜峰之間能夠達(dá)到基線完全分離，并且各峰形較好，整體符合HPLC指紋圖譜要求。故本實驗最終選用V(0.1 mol/L磷酸緩沖鹽)∶V(乙腈)=83∶17作為流動相體系。

2) 流動相中緩沖鹽pH的優(yōu)化

色譜結(jié)果顯示，當(dāng)緩沖鹽pH為6.6時，不能完全達(dá)到基線分離；當(dāng)緩沖鹽pH為6.8時，各色譜峰之間能夠達(dá)到基線完全分離，且分離度大于1.5；當(dāng)緩沖鹽pH為7.0時，亦能達(dá)到基線分離且分離度大于1.5，保留時間延長，峰寬增加。故流動相中緩沖鹽pH選用6.8為最終條件。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗

精密度實驗結(jié)果見表1，2。結(jié)果表明樣品中主要單糖如甘露糖、鼠李糖、葡萄糖等色譜峰的相對保留時間RSD值分別為0.60%，0.58%，0.54%，0.91%，1.03%，0.88%，0.95%，0.89%，0.90%，1.59%，均小于2.0%，相對峰面積RSD值分別為0.56%，0.84%，0.85%，0.33%，0.80%，0.65%，0.57%，0.92%，1.10%，均小于2.0%，表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜的測定要求。

表1 精密度實驗：相對保留時間Table 1 The experiment of precision: relative retention time

表2 精密度實驗：峰面積Table 2 The experiment of precision: peak area

2.3.2 重復(fù)性實驗

重復(fù)性實驗結(jié)果見表3，4。結(jié)果表明樣品中主要單糖如甘露糖、鼠李糖、葡萄糖等色譜峰的相對保留時間RSD值分別為0.71%，0.70%，0.68%，0.95%，0.97%，0.81%，0.83%，0.77%，0.75%，0.79%，均小于4.0%，峰面積RSD值分別為2.3%，3.7%，3.5%，0.7%，1.0%，3.7%，2.1%，2.1%，2.9%，2.3%，均小于4.0%，表明該方法重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜的測定要求。

表3 重復(fù)性實驗：相對保留時間Table 3 The experiment of repeatability: relative retention time

表4 重復(fù)性實驗：峰面積Table 4 The experiment of repeatability: peak area

2.3.3 穩(wěn)定性實驗

穩(wěn)定性實驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明樣品中主要單糖如甘露糖、鼠李糖、葡萄糖等色譜峰的峰面積RSD值分別為2.30%，2.15%，1.81%，0.76%，0.92%，2.17%，2.51%，1.95%，2.45%，2.28%，均小于3.0%，表明該方法穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的測定要求。

表5 穩(wěn)定性實驗：峰面積Table 5 The experiment of stability: peak area

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 混合單糖對照品分析

精密吸取1.2.2節(jié)制備的混合對照品溶液，按照1.2.3節(jié)的色譜條件進(jìn)行檢測，得到色譜圖如圖4所示，混合單糖對照品10 個成分均能達(dá)到基線分離，且分離度均大于1.5，符合系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

1—甘露糖；2—核糖；3—鼠李糖；4—葡萄糖醛酸；5—半乳糖醛酸；6—葡萄糖；7—半乳糖；8—木糖；9—阿拉伯糖；10—巖藻糖。圖4 10種單糖對照品的高效液相色譜圖(n=3)Fig.4 HPLC chromatogram of ten reference monosaccharides (n=3)

2.4.2 共有峰及參照峰的確定

按照1.2.2節(jié)方法制備10批黃芪生脈飲的供試品溶液，按照1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測，色譜分析結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：不同批次樣品均具有基本一致的特征峰，共標(biāo)示出10個主要共有特征峰。利用對照品保留時間以及色譜峰紫外光譜分析，鑒別出10個色譜峰，通過保留時間確定供試品溶液中1號峰為甘露糖，2號峰為核糖，3號峰為鼠李糖，4號峰為葡萄糖醛酸，5號峰為半乳糖醛酸，6號峰為葡萄糖，7號峰為半乳糖，8號峰為木糖，9號峰為阿拉伯糖，10號峰為巖藻糖(圖5)。以峰10巖藻糖為參照峰分別計算各主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表6，7。從單糖組成上可以看出：黃芪生脈飲樣品中葡萄糖和阿拉伯糖的比例最大，其次是半乳糖、半乳糖醛酸、木糖、鼠李糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸、核糖，其中以甘露糖的峰面積比例最小。

圖5 10 批黃芪生脈飲水解物的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of HSD polysaccharide of ten batches samples

表6 10 批黃芪生脈飲水解物指紋圖譜共有峰的相對保留時間(n=3)Table 6 Relativeretention time of common peaks for fingerprints of HSD of ten batches samples(n=3)

表7 10 批黃芪生脈飲水解物指紋圖譜共有峰的相對峰面積Table 7 Relative peaks areas of common peaks for fingerprints of HSD of ten batches samples

2.4.3 相似度分析

采用計算機(jī)輔助相似度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜評價系統(tǒng)軟件2012.13072版)比較10批HSD供試品高效液相色譜指紋圖譜全譜相似度，結(jié)果見表8：10批次HSD供試品高效液相色譜圖譜全譜相似度均大于0.990，表明10 批黃芪生脈飲樣品中含有的多糖成分具有很好的一致性，本方法可用于綜合評價黃芪生脈飲的整體質(zhì)量。

表8 10批HSD樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結(jié)果Table 8 Similarity analysis results of HPLC fingerprint of HSD of ten batches samples

3 結(jié) 論

多糖相對分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、無紫外吸收，因此多糖色譜指紋圖譜的建立比較復(fù)雜。選取從黃芪生脈飲中分離而來的多糖為實驗對象，通過對多糖水解條件、PMP衍生化方法和液相色譜條件的摸索優(yōu)化，建立了黃芪生脈飲多糖HPLC-UV指紋圖譜法。研究結(jié)果表明：建立的HPLC指紋圖譜方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為黃芪生脈飲中多糖水解單糖的質(zhì)量控制研究提供新方法。