基于militarine含量結(jié)合UPLC指紋圖譜的不同產(chǎn)地白及飲片質(zhì)量分析*

劉 娜，袁金鳳，彭詩(shī)濤，柴沖沖，王靖越，張 凱，李欣欣，李 飛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

白及為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.的干燥塊莖，具有收斂止血，消腫生肌的功效[1]。白及的主要成分為白及多糖、聯(lián)芐類(lèi)、二氫菲類(lèi)、菲類(lèi)、聯(lián)菲類(lèi)、黃酮類(lèi)等[2-5]，主要有止血、抗菌、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和抑制黑色素生成等藥理作用[6-10]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》未對(duì)白及的質(zhì)控成分有所規(guī)定?，F(xiàn)代研究表明，1，4-二 [4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯（militarine）具有益智和延緩衰老，防治老年癡呆的功能，且含量較高，是白及中的主要化學(xué)成分之一[11-12]。白及主產(chǎn)于華東、中南、西南及甘肅、陜西等地，以貴州產(chǎn)量最大，質(zhì)量最優(yōu)，有學(xué)者[13-15]對(duì)不同產(chǎn)地的白及藥材指紋圖譜進(jìn)行了研究，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的白及藥材相似度在0.540～1.000，說(shuō)明各產(chǎn)地白及藥材質(zhì)量存在明顯差異。唐修靜等[16]以militarine及浸出物含量為指標(biāo)，對(duì)白及炮制過(guò)程中的軟化方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明蒸透切片militarine及浸出物含量高于煮透切片和潤(rùn)透切片。饒文霞等[17]發(fā)現(xiàn)白及蒸制后烘干法干燥的白及飲片多糖含量高于真空凍干法，生切片則相反。現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》及全國(guó)各省市中藥飲片炮制規(guī)范收載的白及飲片炮制工藝不盡相同，炮制工藝在一定程度上影響飲片質(zhì)量。中藥飲片質(zhì)量與中醫(yī)臨床療效密切相關(guān)，隨著白及在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，白及飲片的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法愈來(lái)愈重要。目前關(guān)于白及的質(zhì)量研究多側(cè)重于原藥材，飲片的研究較少，中藥的療效是多種成分的綜合作用，單一成分往往難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量，因此，本研究擬通過(guò)測(cè)定白及飲片中的militarine含量，結(jié)合其指紋圖譜檢測(cè)，采用多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)收集到的不同產(chǎn)地的24批白及飲片進(jìn)行分析，為白及飲片質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑藥物

1.1 儀器 Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（UPLC）（美國(guó)沃特世科技有限公司，TUV檢測(cè)器，Empower色譜工作站）；SB25-12DTDN型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BT-25S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；Thermo Sorvall Micro 17R微量離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

1.2 試劑藥物 militarine（上海同田生物科技有限公司，批號(hào)58139-23-4，純度≥98%）；乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其余試劑均為分析純（北京化工廠）。共收集到5個(gè)產(chǎn)地24批白及市售飲片，各樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1。由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院楊瑤珺教授鑒定為蘭科植物白及干燥塊莖的加工品。

表1 白及飲片樣品產(chǎn)地信息Tab.1 Sample producing areas information of Bletilae Rhizoma slices

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。以乙腈為流動(dòng)相 A，純水為流動(dòng)相 B，進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，2%～6%A；5～7 min，6%～10%A；7～8 min，10%～16%A；8～9 min，16%～19%A；9～14 min，19%～23%A；14～17 min，23%～30%A；17～25 min，30%～31%A；25～26 min，31%A；26～29 min，31%～55%A；29～34 min，55%A）。分析時(shí)間34 min，流速0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫46℃，進(jìn)樣量2 μL，理論塔板數(shù)不低于100 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取militarine對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇溶解，搖勻，制成每1 mL含對(duì)照品1.6 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取白及飲片，粉碎過(guò)4號(hào)篩，稱(chēng)取粉末1 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL[18]，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理40 min（功率600 W，頻率40 Hz），放置至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，10 000 r/min離心10 min，即得。

2.4 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下militarine對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置 2 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取上述稀釋后的對(duì)照品溶液各2 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），militarine濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。militarine回歸方程 Y=723 038X-1 883.9，r=0.999 9，militarine在1.617～3.234 μg有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2 μL，測(cè)定militarine的峰面積，計(jì)算RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定militarine的峰面積，計(jì)算RSD為0.15%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣 2 μL，測(cè)定 militarine 的峰面積，計(jì)算RSD為0.29%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量白及飲片粉末 6 份，每份約 0.5 g（militarine 含量 6.86 mg/g），精密稱(chēng)定，分別精密加入對(duì)照品適量，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定militarine的峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表2，平均回收率為101%，RSD為0.70%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表2 militarine加樣回收率（n=6）Tab.2 Sample recovery rate of militarine（n=6）

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次2 μL。測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.45%，相對(duì)峰面積RSD小于3.69%，相似度大于0.999，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)樣品6份，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每次進(jìn)樣2 μL。測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.48%，相對(duì)峰面積RSD小于4.68%，相似度大于0.989，表明此方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取S1號(hào)樣品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣 2 μL，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.97%，相對(duì)峰面積RSD小于3.88%，相似度大于0.993，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 測(cè)定方法 取白及飲片樣品，按照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，分別量取對(duì)照品溶液和供試品溶液2 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，即得。對(duì)照品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 含量測(cè)定結(jié)果 取白及飲片樣品，按照2.6項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算樣品含量，militarine含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.2 白及飲片指紋圖譜的建立 取24批不同產(chǎn)地白及飲片，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，采用2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。將得到的24個(gè)色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.1版）軟件進(jìn)行處理。由于S1號(hào)樣品的色譜峰分離度和峰型較好，且基線穩(wěn)定，故選擇S1為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1，選用平均數(shù)法，多點(diǎn)校正后進(jìn)行全譜峰匹配，并生成白及飲片對(duì)照?qǐng)D譜（R）。24批白及飲片UPLC指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜分別見(jiàn)圖2、3。

根據(jù)匹配結(jié)果得出，24批白及飲片共識(shí)別出12個(gè)共有峰。其中9號(hào)峰（17.111 min）為所有樣品共有，且分離度較好，峰位相對(duì)居中，峰面積較大，與對(duì)照品比對(duì)，此峰為白及中聯(lián)芐類(lèi)成分之一，1，4-二 [4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋(píng)果酸酯（militarine），故以此峰作為參照峰計(jì)算其余共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間。不同產(chǎn)地白及飲片的各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD在0%～3.72%之間，各共有峰相對(duì)峰面積RSD在0%～76.96%之間。

3.3 白及飲片指紋圖譜結(jié)果分析

3.3.1 相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012.1版）軟件，以平均數(shù)法，時(shí)間窗為0.1，以S1樣品為參照?qǐng)D譜，計(jì)算各樣品的相似度，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.3.2 聚類(lèi)分析 以24批白及飲片指紋圖譜中12個(gè)共有峰標(biāo)準(zhǔn)化處理后的峰面積作為變量，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，運(yùn)用組間聯(lián)接法，選取平方Euclidean距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示24批樣品可分為四大類(lèi)，其中 S9、S16、S17、S18、S8、S14 等 6 個(gè)樣品聚為一類(lèi)，S20、S21分別獨(dú)自聚為一類(lèi)，其余16個(gè)樣品聚為一類(lèi)。

圖1 對(duì)照品及樣品的色譜圖Fig.1 UPLC chromatogram of reference and samples

表3 militarine含量測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Resultsofmilitarinecontentdetermination（±s，n=3）

表3 militarine含量測(cè)定結(jié)果（±s，n=3）Tab.3 Resultsofmilitarinecontentdetermination（±s，n=3）

編號(hào) militarine含量 編號(hào) militarine含量S1 28.66±0.01 S13 24.44±0.02 S2 31.87±0.01 S14 37.25±0.01 S3 21.96±0.00 S15 18.98±0.01 S4 25.25±0.01 S16 39.81±0.02 S5 30.31±0.00 S17 41.91±0.00 S6 27.77±0.01 S18 33.80±0.00 S7 20.33±0.01 S19 29.93±0.01 S8 44.87±0.01 S20 39.41±0.01 S9 43.17±0.02 S21 41.85±0.01 S10 23.15±0.00 S22 34.35±0.01 S11 32.99±0.01 S23 31.45±0.01 S12 25.49±0.01 S24 22.64±0.02

3.3.3 主成分分析 主成分分析法是一種從眾多原始指標(biāo)之間相互關(guān)系入手，尋找少數(shù)綜合指標(biāo)以概括原始指標(biāo)信息的多元統(tǒng)計(jì)方法，可以充分利用已有的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行綜合分析。運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)24批不同產(chǎn)地白及飲片指紋圖譜中共有峰的峰面積作為變量進(jìn)行主成分分析。KMO和Bartlett球形檢驗(yàn)結(jié)果表明，KMO為0.698，說(shuō)明數(shù)據(jù)適合做因子分析。以特征值應(yīng)大于1為依據(jù)，提取了3個(gè)主成分，3個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率分別是55.108%、19.154%、8.644%，累積方差貢獻(xiàn)率是82.907%，3個(gè)特征值分別是 6.613、2.299、和 1.037。

24批白及飲片成分矩陣見(jiàn)表5。第1主成分的主要信息來(lái)自色譜峰10，第2主成分的主要信息來(lái)自色譜峰7，第3主成分的主要信息來(lái)自色譜峰6，其中9號(hào)峰為militarine。主成分結(jié)果表明色譜峰6、7、10均為關(guān)鍵成分，而現(xiàn)有市場(chǎng)難以買(mǎi)到白及其他標(biāo)準(zhǔn)品，無(wú)法對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵成分進(jìn)行定性，故采用分別計(jì)算其相對(duì)mitarine含量的方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，并計(jì)算各批次樣品中這3個(gè)化合物以及militarine共4個(gè)關(guān)鍵成分的總相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

圖2 24批白及飲片指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜Fig.2 The UPLC fingerprintand control map of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices

圖3 白及飲片對(duì)照指紋圖譜Fig.3 Control fingerprint of Bletilae Rhizoma slices

表4 24批不同產(chǎn)地白及飲片相似度Tab.4 Similarity of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices from different producing areas

圖4 24批白及飲片指紋圖譜聚類(lèi)樹(shù)狀關(guān)系Fig.4 Cluster tree diagram of fingerprint of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices

根據(jù)主成分得分，運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行3-D散點(diǎn)圖進(jìn)行分類(lèi)，分析結(jié)果見(jiàn)圖5。主成分分析分類(lèi)結(jié)果表明，S8、S9、S14、S16、S17、S18、S19 等 6 個(gè)樣品聚為一類(lèi)，S20、S21分別聚為一類(lèi)，其余16個(gè)樣品聚為一類(lèi)。主成分分析分類(lèi)結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致，從而驗(yàn)證了聚類(lèi)分析結(jié)果的可靠性。

4 討論

本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]對(duì)提取方式和提取溶劑進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)其供試品溶液的制備均采用回流提取的方式，未對(duì)超聲提取進(jìn)行考察，且提取溶劑多為50%甲醇，基于此本研究考察了回流和超聲兩種提取方式以及不同濃度甲醇（40%、50%、60%、70%）作為提取溶劑對(duì)指紋圖譜的影響，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇超聲提取方式制備的樣品指紋圖譜整體峰形較好。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)223 nm[20]，270 nm[14]和280 nm[18]3種吸光度下白及飲片指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸光度為270 nm時(shí)，militarine峰形較好，且指紋圖譜峰數(shù)目較多，能更為全面的反映白及飲片整體信息。

圖5 主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis diagram

表5 24批白及飲片成分矩陣Tab.5 Composition matrix of 24 batches of Bletilae Rhizoma slices

研究表明，24批白及飲片militarine含量在18.98～44.87 mg/g之間，其中 S15（貴州）含量低于20.00 mg/g；S8（湖北）與S9（貴州）、S17（湖北）、S21（陜西）4個(gè)批次含量高于40.00 mg/g，其余19個(gè)批次含量均在20.00～40.00 mg/g之間，表明不同批次的白及飲片militarine含量存在一定的差異。

通過(guò)相似度比較，24批白及飲片指紋圖譜相似度在0.812～0.976之間，除S14與S15兩批樣品相似度低于0.9，其余各批次飲片與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均在0.9以上，占樣品數(shù)的92%，表明24批白及飲片的整體質(zhì)量基本穩(wěn)定。S14樣品militarine含量高達(dá)37.25 mg/g，相似度結(jié)果僅為0.822，表明單一成分含量高低與相似度大小的分析結(jié)果不一致。

表6 白及飲片中4種關(guān)鍵成分的相對(duì)含量Tab.6 Relative content of four key components in Bletilae Rhizoma slices mg/g

以12個(gè)共有峰峰面積進(jìn)行聚類(lèi)，結(jié)果顯示24個(gè)樣本可分為 4 類(lèi)，編號(hào)為 S9、S16、S17、S18、S8、S14的6個(gè)批次樣品聚為一類(lèi)，S20、S21分別聚為一類(lèi)，其余16個(gè)批次樣品的militarine含量和指紋圖譜中4個(gè)關(guān)鍵成分的總相對(duì)含量均較低，聚為一類(lèi)。主成分分析結(jié)果表明不能以單一成分評(píng)價(jià)飲片質(zhì)量，且其分類(lèi)結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，與相似度大小關(guān)系不大。

5 結(jié)論

綜上，本研究建立了白及飲片中militarine含量的測(cè)定方法，同時(shí)建立了白及飲片UPLC指紋圖譜。通過(guò)運(yùn)用成分測(cè)定、指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同產(chǎn)地的24批白及飲片進(jìn)行分析，從單一成分到多個(gè)成分含量，再到總體相似度，從多維度分析，認(rèn)為以其主要成分mitarine含量結(jié)合指紋圖譜對(duì)白及飲片質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，具有一定的科學(xué)性和可行性，為白及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考依據(jù)。