京萬紅軟膏對大鼠糖尿病足燙傷的療效及機制研究*

高 艷，崔文鈺，盧志強，崔廣智

（1.天津市兒童醫(yī)院，天津 300134；2.廣東工業(yè)大學，廣州 510006；3.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

糖尿病足是糖尿病患者的一種嚴重的并發(fā)癥，其發(fā)病率高達25%[1]。糖尿病足潰瘍好發(fā)于足趾，燒/燙傷是最常見誘因[2]，其中以低溫燙傷（40～44℃）出現(xiàn)的機率更大[3]。由于糖尿病足患者普遍存在神經病變，溫覺及痛覺等感覺功能減退、甚至喪失，不能及時感受到外源性高溫，易致燙傷。同時，病變的血管僅可維持皮膚組織的生存，無法對創(chuàng)傷和感染等做出自我保護，故對感染難控的糖尿病患者[4]而言，酷似患有創(chuàng)傷愈合衰竭癥[5]。

在臨床中已有報道應用京萬紅軟膏治療糖尿病足效果良好[6-7]，糖尿病足和京萬紅軟膏主治的燒燙傷均具有脈絡瘀阻、血行不暢、電解質紊亂、機體免疫力下降等共性[8]，京萬紅軟膏具有活血消腫、祛瘀止痛、解毒排膿、祛腐生肌的功效，將其運用于大鼠糖尿病足燙傷的治療，評價其藥效并探究其作用機制，望為臨床上糖尿病足燙傷的治療提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠60只：天津市山川紅實驗動物科技有限公司提供，體質量200～220g。

1.2 實驗藥物及試劑 1）京萬紅軟膏（20 g，天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，批號：211692）。2）重組人表皮生長因子外用溶液（rhEGF，2000U×15mL，深圳市華生元素基因工程發(fā)展有限公司）。3）鏈尿佐菌素（STZ，sigma公司，S0310）。4）超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。5）Trnzol總RNA提取試劑盒，RNase Free Water（RT 121-01）、溴化乙錠（EB，RT 203）、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、FastSYBR Mixture（With ROX）試劑盒（北京康為世紀有限公司）。6）DNA Ladder Maker（寶生物工程大連有限公司，D526A）。7）聚合酶鏈反應（PCR）反應引物（上海生工生物工程技術服務有限公司）。

1.3 實驗儀器 美國強生穩(wěn)豪型血糖儀，HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛藍儀器制造有限公司），足趾測量儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司，BW-YLS-7B），電動勻漿機，DU-530紫外分光光度計（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國），7500Fast實時熒光定量PCR儀（LifeTechnologies，F(xiàn)oster City，CA，USA），三恒電泳儀（EPC3000），多功能讀板機（Flex Station 3 型，Molecular Devieces），凝膠成像分析儀（Cuene Genins），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

2 實驗方法

2.1 糖尿病及糖尿病足模型的復制 選用Wistar大鼠60只，雄性，體質量200～220 g。大鼠禁食后，據(jù)空腹體質量以50 mg/kg的劑量腹腔快速注以無菌的檸檬酸緩沖液（pH 4.35）配制而成的1%濃度（質量分數(shù)）的STZ溶液。1周后空腹血糖值大于16.65 mmol/L的大鼠視為糖尿病模型復制成功。

血糖達標的大鼠喂養(yǎng)1個月后，復制大鼠糖尿病足燙傷模型。選用Wistar大鼠45只，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，調節(jié)水浴鍋溫度為（60±1）℃，將大鼠左后足踝關節(jié)上方0.5 cm處做標記，將其以下部分浸入熱水中，保持固定不動，20 s后取出。2 h后大鼠左后足出現(xiàn)明顯紅腫、大水泡，表示深Ⅱ度燙傷模型復制成功 [對深Ⅱ度燙傷的定義為：已傷及真皮層，傷口愈合之后會留下疤痕，大且厚層的水泡蓋住廣泛的區(qū)域，相當于瓦格鈉（Wagner）分級的 3 級][9]。

2.2 分組及給藥方法 造模后，按照大鼠體質量、血糖及造模后瓦格納分級結果將45只大鼠平行分為3組：模型組、京萬紅軟膏組、rhEGF組，每組15只；另外15只大鼠作為假手術組進行對照。造模后當天按照體質量開始給藥，假手術組、模型組均給予空白基質（3 g/kg），京萬紅軟膏組給予京萬紅軟膏（3 g/kg），rhEGF 組給予 rhEGF（4 000 U/10×10 cm2），以無菌紗布包扎，每日1次，連續(xù)換藥14 d。

2.3 足趾體積 在大鼠左后足踩關節(jié)上方0.5 cm處做標記，分別于給藥前、1、3、5 d后用足趾測量儀測量其體積，每只大鼠測量兩次，取平均值。

2.4 Wagner分級 記錄各組大鼠給藥前、5、10、14 d后Wagner分級結果。級數(shù)代表了足部潰瘍的程度，級數(shù)越小，足部損傷程度越小，越接近正常的組織。

Wagner分級標準如下[10]：0 級：皮膚完整；l級：表淺潰瘍；2級：深部潰瘍（影響軟組織）；3級：肌腱韌帶受損、深部膿腫；4級：嚴重感染、骨質破壞、缺損、骨髓炎；5級：濕性或干性壞死、一般需截肢。

2.5 足部宏觀形態(tài) 分別于給藥前、給藥1、3、5、7、10、14 d后對各組大鼠足部進行觀察并記錄圖像。

2.6 SOD、MDA與一氧化氮（NO）的含量 給藥14 d后，處死大鼠，將左后足踝關節(jié)上方0.5 cm標記處以下的足部組織用8%的硫化鈉脫毛擦干取下，小心剔除骨頭，保留全部的皮膚組織制成10%組織勻漿備用。用酶標儀測定SOD、MDA、NO的含量。

2.7 大鼠足部組織中血小板源性生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）mRNA 的表達情況 采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測，首先提取RNA，提取總RNA用核酸蛋白分析儀260 nm測定OD值，計算其RNA含量。將mRNA反轉錄為cDNA，后對cDNA進行擴增。以GAPDH為內參，計算PDGF、TGF-β mRNA的相對表達水平。PCR引物信息見表1。

表1 PCR引物信息Tab.1 PCR primer information

2.8 數(shù)據(jù)采集 PT-PCR具體步驟參考FastSYBR Mixture（With ROX）試劑盒的說明，導出所有孔的CT 值，根據(jù) 2（-ΔΔCT）計算每個基因表達水平的倍數(shù)變化。

2.9 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有顯著性。

3 實驗結果

3.1 足趾體積 給藥5 d后，模型組大鼠的足部多數(shù)不再完整，出現(xiàn)不同程度的斷足，故統(tǒng)計至第5天。給藥前，各給藥組的足趾體積與模型組間沒有統(tǒng)計學差異，足部皮膚均出現(xiàn)明顯的腫脹，大而厚的水泡覆蓋了整個足部。見表2。

表2 大鼠足趾體積的測量結果（±s）Tab.2 Measurement results of toe volume in rats（±s）mL

表2 大鼠足趾體積的測量結果（±s）Tab.2 Measurement results of toe volume in rats（±s）mL

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術組模型組京萬紅軟膏組rhEGF組動物數(shù)12 12 12 12給藥前體積 給藥1 d后 給藥3 d后 給藥5 d后1.672±0.086**1.630±0.085**1.636±0.067**1.622±0.101**3.613±0.600 3.642±0.492 3.094±0.524 2.901±0.304 3.733±0.557 3.186±0.414**2.778±0.420*2.610±0.465*3.547±0.482 3.285±0.341*2.925±0.387 2.713±0.368

與模型組相較，給藥1 d后，京萬紅軟膏組可極顯著的減小足趾體積（P＜0.01），給藥3 d和5 d后，京萬紅軟膏組可顯著減小糖尿病大鼠的足趾體積（P＜0.05），說明京萬紅軟膏可明顯減輕組織充血和水腫，對創(chuàng)面組織具有較好的消腫作用。

3.2 Wagner分級 給藥前，各組大鼠足部損傷程度一致，足部均呈現(xiàn)大且厚層的水泡，全層皮層潰瘍，并侵犯深部組織，為Wagner分級的3級。給藥5 d后，與模型組相比，各給藥組分級結果差異無顯著性。給藥10 d后，模型組足部多為蜂窩組織與大膿腔，而各給藥組新生表皮修復迅速，具有明顯的好轉，與模型組相較，差異具有顯著性（P＜0.01）。給藥14 d后，模型組多數(shù)大鼠足部均出現(xiàn)肢端壞死，甚至斷肢。而各給藥組表皮完整，病灶修復良好，與模型組相較，差異具有顯著性（P＜0.01）。見表3。

表3 Wagner分級結果（±s）Tab.3 Wagner grading results（±s） 級

表3 Wagner分級結果（±s）Tab.3 Wagner grading results（±s） 級

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術組模型組京萬紅軟膏組rhEGF組動物數(shù)12 12 12 12給藥前 給藥5 d后 給藥10 d后給藥14 d后0.00±0.00**0.00±0.00**0.00±0.00**0.00±0.00**3.00±0.00 3.33±0.98 3.25±1.14 4.08±0.90 3.00±0.00 2.83±0.83 2.33±0.49**1.58±0.67**3.00±0.00 2.75±0.75 2.42±0.79**1.75±0.62**

3.3 宏觀形態(tài) 造模后各組大鼠足部形態(tài)無明顯差異，均呈現(xiàn)出大而厚的水泡。隨著給藥天數(shù)的增多，模型組潰瘍程度逐天加重，且水泡逐漸轉變成大膿腔，壞死組織增多，最后甚至出現(xiàn)斷肢。而京萬紅軟膏組、rhEGF組給藥后，腫脹體積逐日減小，對感染的控制、潰瘍及壞死組織的修復良好。見圖 1、2。

3.4 SOD、MDA、NO的測定 與模型組相比，京萬紅軟膏組、rhEGF組可顯著升高SOD的含量（P＜0.05），而對MDA和NO的含量無顯著性影響。見表4。

3.5 京萬紅軟膏對PDGF、TGF-β mRNA表達的影響 與模型組相比，京萬紅軟膏組可顯著的升高PDGF mRNA的表達（P＜0.05），rhEGF組可顯著升高TGF-β mRNA 的表達（P＜0.05）。見圖 3。

4 討論

京萬紅軟膏是由地榆、當歸、黃連、黃柏、紅花等30余種中藥組方而成的純中藥制劑，在燒燙傷、皮膚創(chuàng)傷、術后切口感染、帶狀皰疹、褥瘡等皮膚損傷中均有不同程度的療效[11]，在臨床中可單獨或聯(lián)合運用于糖尿病足的有效治療[12]，研究將京萬紅軟膏作用于大鼠糖尿病足燙傷模型，并探究其機制。

圖1 大鼠足部正面宏觀形態(tài)Fig.1 Macromorphology of the front of rat foot

圖2 大鼠足部背面宏觀形態(tài)Fig.2 Macromorphology of the back of rat foot

表4 SOD、MDA、NO 測定結果（±s）Tab.4 Determination results of SOD，MDA and NO（±s）

表4 SOD、MDA、NO 測定結果（±s）Tab.4 Determination results of SOD，MDA and NO（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別假手術組模型組京萬紅軟膏組rhEGF組動物數(shù)MDA（nmol/mg）SOD（NU/mg）6 6 6 6 NO（μmol/g）36.97±4.85** 0.55±0.23 5.35±1.14 21.58±6.44 0.64±0.16 4.39±2.47 29.60±7.44* 0.66±0.23 5.39±1.13 27.94±6.15* 0.59±0.15 5.12±1.18

圖3 京萬紅軟膏對PDGF、TGF-β mRNA表達的影響Fig.3 Effect of Jingwanhong Ointment on PDGF and TGF-β mRNA expression

SOD是生物體內清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶，可有效地清除過量的氧自由基[13]，是參與氧化應激的重要指標。氧化應激的產生是由于自由基的劇增與體內抗氧化最大清除限度的失衡。當機體處于高糖狀態(tài)時，氧化產物蓄積，過多的自由基可使抗氧化成分SOD發(fā)生過氧化，使之滅活并驟減，誘導氧化應激，從而導致組織與細胞損傷，糖尿病足創(chuàng)面難以愈合?？梢姡嵘悄虿∽銊?chuàng)面處SOD的含量是促進其愈合的關鍵指標。實驗結果表明，京萬紅軟膏組可顯著升高糖尿病大鼠燙傷足部的SOD含量，提示了京萬紅軟膏組能促進大鼠足部燙傷后潰瘍的愈合、減輕氧化應激和炎癥反應、起到改善病情的作用很可能與清除過量的氧自由基相關。

TGF-β可趨化成纖維細胞、表皮細胞和血管內皮細胞的遷徙與增殖，此外，在新生肉芽組織、膠原的形成過程中起關鍵性作用[14]。本研究中，rhEGF組可顯著升高TGF-βmRNA的表達（P＜0.05），可見rhEGF組創(chuàng)面修復等生物學效應的發(fā)揮可能與上調TGF-β mRNA的表達相關。

糖尿病足患者多有血管、神經病變，足部創(chuàng)面常伴隨氧化應激、糖基化終末產物、炎性因子等微環(huán)境異常，這些因素不但使創(chuàng)面遷延不愈，同時也引起PDGF等與創(chuàng)面愈合密切相關的生長因子的含量及生物活性的下降[15]。PDGF可與靶細胞膜上的受體相結合，產生各種重要生物學效應。對于平滑肌、內皮等細胞，具有調控靶細胞增殖、遷移和分化的作用；對炎性細胞、中性粒細粒、巨噬細胞等具有趨化作用，此外，可誘導磷脂酞肌醇和花生四烯酸的釋放，參與前列腺素、細胞外基質的合成，促進肉芽組織的生長[16]。實驗結果表明，京萬紅軟膏組具有促進PDGF mRNA表達上調的趨勢（P＜0.05），可見在糖尿病大鼠燙傷的足部組織中，傷口的愈合作用很可能與PDGF mRNA的生物學效應的發(fā)揮相關。

京萬紅軟膏針對大鼠糖尿病足燙傷，通過促進表皮消腫、控制感染、祛除壞死組織等達到創(chuàng)面修復目的，可顯著升高潰瘍組織中SOD的含量和PDGF mRNA的表達，提示京萬紅軟膏對糖尿病足的愈合作用可能與消除過量的氧自由基，調控與創(chuàng)面愈合及組織修復具有重要作用的修復生長因子血小板源性生長因子PDGF相關，值得在臨床上應用及進一步研究。