基于藥效學(xué)效果結(jié)合化學(xué)指標(biāo)優(yōu)選小兒汗停顆粒提取工藝

王倫，朱麗玲，鄒榮，吳寧，許漢林

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430065；2.武漢軍谷坊科技開發(fā)有限公司，武漢 430075)

氣虛型自汗、盜汗是兒科臨床上的常見病，治宜補(bǔ)氣，固表止汗。小兒汗停顆粒方由黃芪、炒白術(shù)、防風(fēng)、煅牡蠣、麻黃根等5味藥組成，在玉屏風(fēng)散[1]及牡蠣散[2-4]基礎(chǔ)上化裁而成，是湖北省武穴市某醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，療效確切。該方君藥黃芪以皂苷、黃酮類成分為主要目標(biāo)成分，其皂苷類代表性成分黃芪甲苷和黃酮類的代表性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，作為本品的指標(biāo)性成分[5-6]，利用全方水提、水提+提揮發(fā)油、部分醇提、水提醇沉4種工藝路線[7-11]，通過正交設(shè)計(jì)，以指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率和收膏率為指標(biāo)，確定黃芪等四味藥的最佳水提取工藝，以現(xiàn)代藥效學(xué)研究中對(duì)大鼠足跖部皮膚汗點(diǎn)的作用，篩選出指標(biāo)成分最高、療效最好的制備工藝[12-14]，旨在為小兒汗停顆粒的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 動(dòng)物、試藥與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005。大鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度24～28 ℃，濕度50%～60%，飼料按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠大鼠配合飼料》進(jìn)行配制，飲水為純凈水。

1.2藥物與試劑 小兒汗停顆粒A、B、C、D，由武漢軍谷坊科技開發(fā)有限公司提供，分別用純化水配成10%和20%的溶液備用；虛汗停顆粒，廣州奇星藥業(yè)有限公司，批號(hào)：2087；蓖麻油，湖北科田藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130102；硝酸毛果蕓香堿滴眼液，沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司，批號(hào)：130801；硫酸阿托品注射液，上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：110901B；無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20090224；碘劑，天津博迪化工股份有限公司，批號(hào)：20120901；可溶性淀粉，天津市福晨化學(xué)試劑廠，20080602。

1.3儀器 高效液相色譜儀(LC-20AT，日本島津公司)；40KHZ超聲波清洗機(jī)(潔拓電子有限公司)；萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；中藥粉粹機(jī)(旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1工藝路線設(shè)計(jì) 本方為中醫(yī)經(jīng)典方玉屏風(fēng)散合牡蠣散化裁而成，本品功能主治為益氣固表、斂陰止汗。適用于小兒自汗、盜汗屬氣陰兩虛癥。文獻(xiàn)報(bào)道，中醫(yī)的氣虛與機(jī)體的免疫功能低下有關(guān)。衛(wèi)氣的防御作用是衛(wèi)氣的重要功能之一，其理論建筑在《內(nèi)經(jīng)》“陽(yáng)因而上，衛(wèi)外者也”、“陽(yáng)者，衛(wèi)外而為固也”(《素問·生氣通天論》)及“衛(wèi)氣不營(yíng)，邪氣居之”(《靈樞·上膈篇》)等論述基礎(chǔ)上。近年來(lái)，有關(guān)衛(wèi)氣防御作用的研究取得了較多的成果，主要表現(xiàn)在衛(wèi)氣防御作用與現(xiàn)代免疫學(xué)之間的關(guān)聯(lián)得到了初步的闡明。根據(jù)本品功能主治及方中各藥味所含成分的分析，筆者以各藥味中具有調(diào)節(jié)免疫作用的成分為目標(biāo)，并參考《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部玉屏風(fēng)顆粒和部標(biāo)十四冊(cè)虛汗停顆粒制法項(xiàng)下方法，進(jìn)行提取工藝路線的設(shè)計(jì)，方案如下。

工藝路線一(A)：取方中牡蠣按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳工藝提取，加6倍量水，煎煮3次，每次1 h，濾過，合并濾液備用；將其余黃芪等四味藥加水提取，濾過，濾液與上述牡蠣濾液合并，減壓濃縮至稠膏，減壓干燥，得干膏。通過正交設(shè)計(jì)，以指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率和收膏率為指標(biāo)，確定黃芪等4味藥的最佳水提取工藝。

工藝路線二(B)：取方中牡蠣按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳工藝提取(同線路一)，提取液濾過，濾液備用；另取黃芪、防風(fēng)加一定濃度的醇回流提取，合并醇提液，濾過，濾液備用，藥渣與白術(shù)、麻黃根兩味藥按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳水提工藝提取，提取液與上述兩濾液合并，減壓濃縮至稠膏，減壓干燥，得干膏。通過正交設(shè)計(jì)，以指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率和收膏率為指標(biāo)，確定黃芪、防風(fēng)的最佳醇提工藝。

工藝路線三(C)：取方中五味藥，加6倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮至藥材-清膏比(1.5：1)(相對(duì)密度1.17～1.18，50 ℃)，加95%乙醇至含醇量為50%，靜置36 h，分離上清液，下層抽濾得濾液，濾液與上清液合并，減壓回收乙醇并濃縮至稠膏，減壓干燥至干膏。通過正交設(shè)計(jì)，以指標(biāo)性成分的轉(zhuǎn)移率和收膏率為指標(biāo)，確定最佳的醇沉工藝。

工藝路線四(D)：取方中牡蠣按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳工藝提取(同線路一)，提取液濾過，濾液備用；將防風(fēng)、炒白術(shù)，按正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳揮發(fā)油提取工藝，提取揮發(fā)油，備用，提取液濾過，濾液備用；取黃芪、麻黃根按工藝一確定的最佳條件提取，濾過，濾液與上述兩濾液合并，濃縮至稠膏，減壓干燥至干膏，噴入揮發(fā)油。

取2/5處方量藥材4份，分別按照以上確定的四條工藝路線提取得干膏，并制得藥效學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的樣品，結(jié)果見表1。

表1 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品制備

按干膏總量的70%取四條工藝路線所得的干膏粉，分別加淀粉至210 g，充分混勻，其中工藝路線四混勻后噴入提取所得揮發(fā)油，混勻，密閉過夜。所制得的樣品，每1 g藥粉相當(dāng)于生藥 3.3 g。

2.2藥效學(xué)研究

2.2.1分組及給藥 取SD大鼠96只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為12組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，小兒止汗停顆粒，A工藝小、大劑量組，B工藝小、大劑量組，C工藝小、大劑量組，D工藝小、大劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組(即虛汗停組和阿托品組)。A、B、C、D工藝小、大劑量組分別灌胃給予10%，20% A、B、C、D制劑溶液，劑量為1 mL·(100 g)-1，虛汗停組灌胃給予虛汗停溶液7.5 g·kg-1，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予等容量純化水，每天2次，連續(xù)7 d。阿托品組最后一次給藥時(shí)皮下注射阿托品0.25 mg·kg-1。

2.2.2實(shí)驗(yàn)方法 末次給藥后30 min，參照文獻(xiàn)方法改進(jìn)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：除正常對(duì)照組大鼠外，各組大鼠分別皮下注射1 mg·kg-1毛果蕓香堿。用硬紙板固定所有大鼠，暴露固定右后肢，用棉簽蘸取無(wú)水乙醇輕輕將足跖部污物擦洗干凈。15 min后，用干凈棉簽將各組大鼠足跖部原有的和由于固定時(shí)掙扎所致的汗液輕輕拭干，于大鼠足跖部皮膚涂上和田-高垣氏試劑A液，待充分干燥后，再薄薄涂上B液，分別于10和20 min用相機(jī)攝影，在電腦上計(jì)數(shù)深紫色著色點(diǎn)(即汗點(diǎn))出現(xiàn)的數(shù)量。

3 結(jié)果

各組大鼠排汗情況見表2。動(dòng)物造模后，各時(shí)間點(diǎn)的汗點(diǎn)均有明顯增多，與正常組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

與模型對(duì)照組比較，A、B、C、D 4種工藝所制的小兒汗停顆粒均有減少大鼠足跖部皮膚汗點(diǎn)的作用，其中A、D工藝所制的小兒汗停顆粒有顯著減少大鼠足跖部皮膚汗點(diǎn)的作用。

可見，A、B、C、D工藝獲得的制劑D工藝效果最好，A工藝次之，B、C工藝與模型對(duì)照組相比，汗點(diǎn)較少，但無(wú)顯著性差異，止汗效果不明顯，故D工藝即水提醇沉工藝為最佳工藝。

表2 各組大鼠排汗情況比較

Tab.2Comparisonofsweatingineachgroupofrats

組別大鼠/只10 min汗點(diǎn)20 min汗點(diǎn)正常對(duì)照組8 220.63±40.84231.13±41.93模型對(duì)照組6 274.17±42.39① 286.33±46.67①虛汗停組8 184.00±49.52② 192.13±51.89②阿托品組8 0.00±0.00② 0.00±0.00②A工藝 小劑量組8 213.63±54.73③234.25±55.49③ 大劑量組8 208.00±40.51③222.50±43.75③B工藝 小劑量組8 238.00±48.07255.13±48.41 大劑量組7 237.71±54.79249.00±55.37C工藝 小劑量組7 234.00±30.23244.00±32.93 大劑量組8 249.50±30.65262.00±28.77D工藝 小劑量組8 200.88±41.06②213.88±40.17② 大劑量組7 192.71±32.44②209.14±33.98②

①與正常對(duì)照組比較，F(xiàn)=15.12，15.41，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)=12.76～17.67，P<0.01；③與模型對(duì)照組比較，F(xiàn)=14.25～15.61，P<0.05。

①Compared with the normal control group，F(xiàn)=15.12，15.41，P<0.05； ②Compared with the model control group，F(xiàn)=12.76-17.67，P<0.01； ③Compared with the model control group，F(xiàn)=14.25-15.61，P<0.05.

4 討論

由小兒汗停顆粒處方中各味藥可以看出，本方君藥黃芪所含的皂苷、黃酮、多糖類成分均有免疫調(diào)節(jié)的作用[15-17]，從目前已上市的中成藥玉屏風(fēng)顆粒和虛汗停顆粒的處方和制法分析，其均含黃芪，且均采用水提醇沉工藝，以皂苷、黃酮類成分為主要目標(biāo)成分，兼顧部分多糖類成分的提取[18-20]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010年版一部中黃芪藥材分別測(cè)定了皂苷類的代表性成分黃芪甲苷和黃酮類的代表性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，筆者亦選用了此兩成分作為本品的指標(biāo)性成分。白術(shù)內(nèi)酯、揮發(fā)油、多糖均有與本品功能主治相關(guān)的藥理作用，通過不同的工藝路線進(jìn)行篩選，防風(fēng)所含的色原酮類成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷以及揮發(fā)油類成分是其有效成分，但對(duì)本品的功能主治來(lái)說，不是主要的藥效成分，將其作為參考指標(biāo)，其多糖類成分具有明顯的增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，與本品功能主治相關(guān)。麻黃根和煅牡蠣根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道，其起效機(jī)制和成分并不明確，以收膏率作為其考察指標(biāo)。從藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品制備可知，指標(biāo)性成分黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄苷的轉(zhuǎn)移率，均為水提醇沉工藝最高，全方水提工藝次之，與藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小兒汗停顆粒最佳工藝為水提醇沉法，原料價(jià)廉易得且易于控溫，但水提醇沉法也有一些不足：水的極性大，在提取多糖類指標(biāo)性成分時(shí)，容易將植物體所含的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)一同提取出來(lái)，并且都被乙醇沉淀，從而減少非有效成分的含量。水提醇沉法對(duì)溫度也有一定的要求，冷卻后加入醇，加入的方式是慢加快攪，若未等到藥液冷卻便加入乙醇，則會(huì)導(dǎo)致乙醇受熱損失，局部醇濃度過高造成有效成分被包裹而損失。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的不足之處在于對(duì)大鼠足跖部皮膚汗點(diǎn)的計(jì)數(shù)上，本實(shí)驗(yàn)采用的方法是于大鼠足跖部皮膚分別涂抹和田-高垣氏試劑A液和B液，分別于10 min和20 min用相機(jī)拍照，在電腦上計(jì)數(shù)深紫色著色點(diǎn)(即汗點(diǎn))出現(xiàn)的數(shù)量，由文獻(xiàn)方法優(yōu)化而來(lái)，此方法對(duì)于汗點(diǎn)的技術(shù)精確度不高，而且人為計(jì)數(shù)誤差較大，目前筆者尚未見更準(zhǔn)確可靠的方法對(duì)大鼠皮膚汗點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，故有待進(jìn)一步研究。