氫磁共振定量法測定地氯雷他定片含量*

張雪曉，李陽杰，崔曉鴿，鄭巖

(1.鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校，鄭州 450064；2.鄭州工業(yè)應用技術學院，鄭州 451150；3.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203)

高強度磁場技術不斷發(fā)展和傅里葉變換的應用，為磁共振技術應用于定量分析領域奠定了堅實的基礎[1]。近年來《中華人民共和國藥典》 《英國藥典》《美國藥典》《日本藥局方》及《歐洲藥典》等均收載了定量核磁技術。磁共振定量法(quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR)應用最為廣泛的是氫磁共振定量法(quantitative proton nuclear magnetic resona-nce，qHNMR)，其定量準確度可以接近高效液相色譜(HPLC)法水平[2-6]。含量測定大多采用內標法，即以結構和含量已知的化合物作為內標，與待分析成分配制成混合溶液進行同時測定，通過比較兩者的積分面積確定待測成分的含量[6-8]。

地氯雷他定(desloratadine)化學名為8-氯-6，11-二氫-11-(4-哌啶烯基)-5H-苯并[5，6]環(huán)庚基[1，2-b]吡啶。地氯雷他定片主要用于緩解慢性特發(fā)性蕁麻疹及常年性變應性鼻炎的全身及局部癥狀[9]。雖然國家藥典委員會于2012年修訂地氯雷他定片[標準號為WS1-(X-401)-2004Z]的國家標準，但2015年版《中華人民共和國藥典》仍未收錄該品種。修訂版標準中地氯雷他定片的含量測定采用HPLC法，需要對其雜質進行分離，且引入校正因子后才能得出含量。鑒別采用HPLC法和紫外-可見分光光度法，操作過程較為繁瑣，且各類試劑消耗量大，費時費力。因而建立一種簡單、快速、準確的含量測定方法及鑒別方法顯得意義重大。qNMR法是一種含量測定和鑒別、鑒定同時進行的分析方法，近年來越來越多地應用于藥物分析領域。本研究采用1H-NMR法對地氯雷他定片進行鑒別、鑒定，qHNMR法測定地氯雷他定含量，為地氯雷他定片質量控制提供新的分析方法，也為qHNMR法進一步推廣提供有價值的經驗[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 400 MHz磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司，型號：AvanceIII型)；高效液相色譜儀(安捷倫公司，型號：1200型，包括四元高壓液相泵、自動進樣器、DAD檢測器)；電子分析天平(METTLER TOLEDO精密儀器有限公司，型號：AB265-S型，感量：0.01 mg)。

1.2試藥 地氯雷他定片(上海先靈葆雅制藥有限公司，批號：20170201，20170204和20170205)；地氯雷他定對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：99.6%，批號：100919-201402)；氘代三氯甲烷(CDCl3，美國Sigma公司)；1，2，4，5-四氯苯(美國Sigma公司，批號：34379)；磷酸二氫鉀(國藥化學試劑有限公司，批號：20161105)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1測試條件 qHNMR法：采用zg30脈沖序列，測定溫度為26.85 ℃，譜寬(SWH)為8012 Hz，采樣時間(AQ)為4.01 s，弛豫時間(D1)為15 s，脈沖寬度(P1)9.54 s，樣品掃描次數(NS)48次，空掃次數為2次。HPLC法：色譜柱為Agilent EXTEND RDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長為242 nm；流動相為甲醇-10 mmol·L-1磷酸二氫鉀(45：55)；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為20 μL。

2.2內標、對照品與供試品溶液配制

2.2.1內標溶液與對照品溶液的配制 精密稱取1，2，4，5-四氯苯100.0 mg于50 mL量瓶中，加入CDCl3，加熱溶解后混勻，得濃度為2.0 mg·mL-1的內標溶液，密封后于冰箱保存。精密稱取地氯雷他定對照品12.00 mg置于10 mL量瓶中，加入CDCl3，加熱溶解后混勻，得濃度為1.2 mg·mL-1的對照品溶液，密封后置于冰箱保存。

2.2.2供試品溶液的配制 取地氯雷他定片15片，于研缽中研細。以地氯雷他定計，精密稱取約10 mg，采用內標溶液定容至5 mL。取0.5 mL轉移至5 mm核磁管中，待測。

2.31H-NMR鑒別 取片劑研磨后粉末適量，加入CDCl3后超聲，測試1H-NMR(400MHz，CDCl3)。測試結果如下δ：8.33～8.44(m，1H)，7.41～7.48(d，1H)，7.13～7.30(t，3H)，7.01～7.22(t，1H)，3.31～3.64(t，2H)，3.01～3.15(m，2H)，2.76～2.91(m，2H)，2.61～2.35(m，3H)，2.35～2.51(m，1H)，1.40～1.91(br，1H)。1H-NMR譜的芳香區(qū)(δ7.22～7.44)顯示了地氯雷他定結構中6個芳香氫信號。高場區(qū)(δ2.35～3.64)共顯示12個質子峰，對應于結構中6個亞甲基(部分質子信號發(fā)生重疊)；δ：1.40～1.91為地氯雷他定結構式中-NH質子峰。綜上所述，1H-NMR圖譜與地氯雷他定分子式(C19H19ClN2)相符。

2.4qHNMR法測定地氯雷他定片含量

2.4.1專屬性考察 取“2.2.2”項下配制的地氯雷他定與1，2，4，5-四氯苯混合溶液，獲取1H-NMR，調整相位及基線后以CDCl3溶劑峰進行定標 。結果，1，2，4，5-四氯苯內標峰δ7.59與地氯雷他定的定量峰δ7.41～7.48完全分離，互不干擾。與未加內標的地氯雷他定1H-NMR相比較，加內標后1H-NMR譜中地氯雷他定各質子峰化學位移均未發(fā)生變化，表明內標物質1，2，4，5-四氯苯與地氯雷他定兩者可穩(wěn)定存在。

2.4.2方法學驗證 qHNMR法測定藥物含量時定量峰和內標峰積分范圍的確定至關重要。選擇目標峰進行積分時，應將峰譜圖放大，且選取峰形輪廓線與水平基線重合處為其起止點，在此積分原則情況下進而進行方法學研究。

參考“2.2.1”項下配制方法，采用內標溶液配制質量濃度為1.84，3.69，6.08，9.37和11.86 mg·mL-1地氯雷他定一系列對照品溶液，轉移0.5 mL至核磁管中，進樣測定、獲取各濃度的1H-NMR譜。地氯雷他定各濃度的1H-NMR譜調整相位及基線后，以地氯雷他定定量峰與內標峰峰面積之比為橫坐標(X)，兩者質量濃度比為縱坐標(Y)進行線性回歸，得回歸方程：Y=2.214 6X+0.100 8(r=0.999 3)。表明地氯雷他定在1.84～11.86 mg·mL-1的范圍內，地氯雷他定定量峰峰面積與對應的質量濃度呈良好的線性關系。

取“2.2.2”項下供試品溶液，連續(xù)測定6次，以定量峰與內標峰面積比值為參考(AS/Ar)，并計算相對標準偏差(RSD)，結果顯示RSD值為0.83%。取供試品溶液，分別于0，1，2，3，5 h進樣測定。以定量峰與內標峰面積比值為參考(AS/Ar)，計算RSD值為1.42%，表明樣品溶液在測試環(huán)境5 h內穩(wěn)定。取地氯雷他定對照品溶液，逐步稀釋。以信噪比(S/N)為10時，作為定量下限(LOQ)。以S/N值為3時，作為檢出限(LOD)[8-9]。結果表明，LOQ為249.0 ng·mL-1，LOD為60.8 ng·mL-1。于地氯雷他定供試品溶液中分別加入低、中、高濃度地氯雷他定對照品，平行配制3份。按照“2.1”項下qHNMR方法進行測試并計算回收率，結果見表1。低、中、高濃度回收率98.80%～100.82%，平均回收率分別為101.61%，100.29%，99.75%，RSD分別為2.10%，1.52%，0.76%(n=3)。

表1 地氯雷他定的回收率實驗結果

2.3質量平衡法與氫磁共振法測定結果 qNMR法計算公式為：Wu=WsAuEu/AsEs。式中：Wu為地氯雷他定質量(mg)；Au為地氯雷他定定量峰面積；As為內標峰面積；Ws為內標質量(mg)；Eu為地氯雷他定質子當量(地氯雷他定相對分子質量與定量峰代表的質子數之比)；Es為內標質子當量(內標相對分子質量與內標峰代表的質子數之比)。

取3批地氯雷他定片劑，分別采用HPLC法和qHNMR法測定地氯雷他定片中地氯雷他定的含量，結果見表2?？梢奌PLC法與qHNMR法測定結果基本一致。

表2 2種方法測定地氯雷他定片中地氯雷他定的含量比較

Tab.2Comparisonofdesloratadinecontentindicloratadinetabletsbytwomethods

mg/片

3 討論

qHNMR法用于測定藥物含量時，弛豫時間，采樣次數等儀器參數對含量測定結果也有一定影響[3-6]。采集時間與圖譜的分辨率有較大關系，若采集時間小于信號完全衰減成噪音時間，由于截尾效應會把假信號帶入qHNMR圖譜，從而導致圖譜產生畸變。若采集時間大于信號完全衰減成噪音時間，則會增加測試時間。經考察，最終選用采集時間為4.01 s。弛豫時間和采樣次數的確定是以定量峰和內標峰比值(Ax/As)趨于穩(wěn)定時的初始值為參考，可以保證采用較短測試時間的情況下，提高qHNMR法準確性。分子結構中甲基、亞甲基、次甲基、芳香氫等質子的弛豫機制的不同，因而氫質子恢復Boltzmann 平衡程度不同。所以定量峰和內標峰應選擇同一類型氫質子，提高qHNMR積分結果的一致性及準確性，本研究采用的定量峰和內標峰均為芳香質子。

采用qHNMR法測定藥物含量時，內標物質對qHNMR分析測試的準確性也有很大影響[3-5，10]。前期對馬來酸、1，2，4，5-四氯苯、富馬酸二甲酯、對苯二甲酸二甲酯，苯甲酸卞酯等進行了考察。發(fā)現馬來酸和1，2，4，5-四氯苯與地氯雷他定質子峰可完全分離。但地氯雷他定結構式中含2個N原子，呈一定的堿性；而馬來酸結構式含2個-COOH，呈一定的酸性，為保證所選內標物質不與地氯雷他定發(fā)生反應，進而影響qHNMR測定結果，最終選用1，2，4，5-四氯苯作為內標物質，并進行一系列方法學驗證。地氯雷他定含量測定結果顯示，qHNMR法與HPLC法測定結果較為接近，但qHNMR法具有快速、簡單、準確等優(yōu)勢，且可實現定性鑒別、鑒定和含量測定同步進行，為應用于藥物的質量控制奠定了基礎，有助于qHNMR法將來在藥學研究領域發(fā)揮越來越重要的作用。