蔥白提取物對心肌梗死模型大鼠心肌纖維化及TGF-β1與Smad2蛋白表達的影響*

趙輝，邢若丹，謝婷婷，馬威，楊文強，余志華，田立群，吳勇宏，柯于鶴

(1.武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院老年病科，武漢 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院，武漢 430065；3.武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院心血管內科，武漢 430022)

心肌纖維化是指心肌膠原纖維過量沉積和比例失調最終導致心功能不全的一種病理變化，其在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用，抑制心肌纖維化是治療心力衰竭的一個重要靶點[1]。心肌纖維化是心臟慢性炎癥病變的過程，是多種致病因子長期作用的結果。其中白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α被認為是心肌纖維化過程中的胞外刺激因素，而血清腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)濃度反映心功能的情況，可用于診斷心力衰竭，評估療效和預后[2]。轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1是重要的促心肌纖維化調控因子，Smads蛋白通過介導TGF-β1細胞內信號傳導促進心肌梗死后纖維化的發(fā)生，TGF-β/Smads 信號通路與心肌纖維化密切相關[3]。蔥白味辛，性溫，具有發(fā)汗解表、散寒通陽的作用，現(xiàn)代藥理研究提示蔥白提取物具有抑制炎癥反應、抗氧化、調脂、擴張冠脈等作用[4]。本實驗通過觀察蔥白提取物對心肌梗死后心力衰竭大鼠炎癥指標、TGF-β1及Smad2蛋白表達的影響，探討蔥白提取物抑制心肌纖維化，逆轉心室重構的作用，為其臨床應用于心力衰竭治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD雄性大鼠65只，體質量(260±10)g，購自湖北省疾病預防控制中心，動物合格證號：42000600026538，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2017-0065，實驗動物設施使用證號：00266125。大鼠飼養(yǎng)于室溫(20～24 ℃)、相對濕度45%～55%環(huán)境，12 h/12 h明暗交替，給予充足滅菌飲食，適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2藥物與試劑 蔥白提取物(武漢中西醫(yī)結合醫(yī)院藥物制劑中心制備，批號：2015023116)，聚山梨酯-80(北京邁瑞達科技公司，M1667)配成濃度0.07%混懸液；培哚普利(8 mg/片，天津制藥廠生產(chǎn)，批準文號：H20103382)，純化水配成濃度0.07%的混懸液。大鼠IL-6、TNF-α、BNP試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號：E-EL-R1025C、E-EL-R0019C、E-EL-R0016C)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量檢測試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G2026)、一抗(艾博抗上海貿(mào)易有限公司，貨號：TGF-β1ab27969、Smad2 ab40855)、二抗(艾博抗上海貿(mào)易有限公司，貨號：辣根過氧化物酶標記山羊抗兔GB23303 )、dNTP(北京天根生化科技有限公司，貨號：LOT#P4325)、HiScript Reverse Transcriptase(RNase H)(南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：R101-01/02)、Taq Plus DNA Polymerase(北京天根生化科技有限公司，貨號：ET105-01)。

1.3主要儀器 DHG 9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，JY300 水平電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)，C2500-R-230V微型高速離心機(美國)，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡，Alpha InnotechalphaEaseFC型灰度分析儀，ABI QuantStudio 6型實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀等。

1.4模型制備 參照文獻[5]制備大鼠心力衰竭模型，大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，術前 12 h禁食、6 h禁水，9.9%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，背位固定，頸部及胸部備皮、消毒，連接心電圖，經(jīng)喉氣管插管連接小動物呼吸機。于大鼠左胸第3～4肋間開胸，暴露心臟，撕裂心包膜后，在左心耳下2 mm處以6號線穿過結扎，以心電圖I、II 導聯(lián) ST段抬高及左心室搏動減弱，左心室前壁顏色變淺、變白為結扎成功標志，手術后放回心臟，縫合胸腔，回籠飼養(yǎng)1周。假手術組只穿針，不結扎。造模過程中，大鼠共存活54只，死亡11只，死亡率16.9%，其中假手術組無死亡。

1.5模型分組及給藥 按大鼠體質量采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組，模型對照組，蔥白提取物小、中、大劑量組(簡稱蔥白小、中、大劑量組)，培哚普利組，每組9只，按照《人和動物及各類動物間藥物劑量的換算方法》[6]，以成人每日常用劑量進行大鼠與人的用藥量換算，蔥白小、中、大劑量組分別給予1，2，4 mg·kg-1蔥白提取物灌胃，培哚普利組給予2 mg·kg-1培哚普利混懸液灌胃，模型對照組和假手術組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，每日1次，連續(xù)藥液灌胃12周。

1.6標本采集和檢測指標 給藥12周后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測大鼠血清中BNP、IL-6、TNF-α含量。取心肌組織石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色，中性樹膠封片后，顯微鏡下觀察并拍照分析。Masson染色切片通過Image J圖像分析軟件計算心肌組織膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF )，即選定區(qū)域藍色組織(膠原纖維)占總染色組織面積的百分比，每張切片隨機取5個(×100倍)視野測量，取其平均值。

1.7Western blotting法檢測心肌TGF-β1、Smad2蛋白表達 取適量大鼠心肌組織，BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，計算相應蛋白上樣量并加入相應緩沖鹽，加熱變性10 min行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)分離，取出電泳凝膠轉膜，轉好的膜于室溫下脫色搖床上用5%脫脂牛奶(0.5%三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽含聚山梨酯-20緩沖液配制)，封閉1 h。然后根據(jù)一抗試劑說明書加入稀釋一抗(1：2000)，4 ℃孵育過夜，孵育膜需三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽含聚山梨酯-20緩沖液洗5 min×3次；再加入稀釋二抗(1：3000)，室溫下孵育30 min后，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽含聚山梨酯-20緩沖液洗5 min×3次，最后用電化學發(fā)光試劑盒檢測顯色條帶強弱，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。

1.8實時熒光定量PCR法檢測心肌TGF-β1、smad2 mRNA的表達 Trizol法提取總RNA，用微量分光光度計測定溶解后的RNA的吸光度(A)值，以此計算RNA的濃度和純度。反轉錄按試劑盒說明書操作，取總RNA4.96 μg，在反轉錄酶Hiscript Reverse Transcriptase和引物 olig(dT)18條件下進行反轉錄，得到cDNA鏈，并據(jù)此將每個樣本的cDNA濃度稀釋10倍。PCR反應體系為：cDNA4 μL、上下游引物各0.4 μL、SYBR Green Master Mix 10 μL、50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL、H2O 4.8 μL。所用引物由擎科生物公司合成。TGF-β1上游引物：5′-GTGGCTGAACCAAGGAGACGGAATA-3′，下游引物：5′- ACCTCGACGTTTGGGACTGATC-3′，產(chǎn)物長度118 bp；smad2上游引物：5′- GGCTGAACTGTCTCC-TACCACTCTC-3′，下游引物：5′- ACCTATGTAATAC-AAGCGCACTCCC-3′，產(chǎn)物長度289 bp；GAPDH上游引物：5′- ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′- TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，產(chǎn)物長度253 bp。以GAPDH 作為內參照，循環(huán)參數(shù)：預變性50 ℃×2 min，變性95 ℃×10 min，退火95 ℃×30 s，延伸60 ℃×30 s，共40個循環(huán)。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析。

2 結果

2.1各組大鼠BNP、TNF-α、IL-6水平比較 模型對照組BNP、TNF-α、IL-6較假手術組均顯著增高(P<0.01)；培哚普利組和蔥白小、中、大劑量組BNP、TNF-α、IL-6含量均較模型對照組顯著降低(P<0.01)。與蔥白大劑量組比較，蔥白小劑量組BNP含量顯著增高(P<0.01)；蔥白小劑量組、蔥白中劑量組TNF-α含量顯著增高(P<0.01)；蔥白小劑量組IL-6含量顯著增高(P<0.01)。與培哚普利組比較，蔥白小劑量組BNP含量顯著增高(P<0.01)，蔥白小劑量組、蔥白中劑量組TNF-α含量顯著增高(P<0.01)。 見表1。

表1 6組大鼠BNP、TNF-α、IL-6含量比較

Tab.1ComparisonofthecontentofBNP，TNF-αandIL-6amongsixgroupsofrats

組別BNPTNF-αIL-6假手術組246.5±33.8101.0±16.1155.0±15.2模型對照組539.7±53.4①408.5±57.0①355.5±39.5①培哚普利組310.4±39.3248.0±35.4246.6±38.3蔥白 小劑量組361.8±42.2②318.5±46.5②276.6±32.7② 中劑量組325.6±43.0③308.6±35.2②252.4±37.6 大劑量組280.4±35.4235.6±42.5222.5±39.3F35.88730.79317.409P0.0000.0000.000

①與假手術組比較，t=7.561，24.780，22.010，P<0.01；②與蔥白大劑量組比較，t=6.444，6.448，4.189，6.753，P<0.01；③與蔥白大劑量組比較，t=3.647，P<0.05。

①Compared with the sham operation group，t=7.561，24.780，22.010，P<0.01；②Compared with the high-dose Allium Stalk group，t=6.444，6.448，4.189，6.753，P<0.01；③ Compared with the high-dose Allium Stalk group，t=3.647，P<0.05.

2.2各組大鼠心臟組織HE染色及Masson染色結果 HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞結構完整、排列整齊，少量壞死心肌細胞，炎癥細胞局部浸潤；模型對照組大鼠心肌細胞水腫、壞死明顯，結構破壞、排列凌亂，壞死區(qū)域可見結締組織增生，大量炎癥細胞浸潤。藥物干預后，與模型對照組相比，各治療組大鼠心肌細胞水腫、壞死數(shù)量均減少，局部可見完整心肌細胞，結締組織增生較輕，炎癥細胞浸潤面積縮小，其中蔥白大劑量組和培哚普利組心肌細胞水腫、壞死數(shù)量減少較蔥白小、中劑量組顯著，保留完整心肌細胞數(shù)量較多(圖1)。

Masson染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織排列整齊，染色均勻，基本無膠原纖維；心肌梗死導致模型對照組大鼠心肌組織破壞嚴重，心肌細胞殘存較少，膠原纖維增加明顯，出現(xiàn)顯著心室重塑表現(xiàn)。藥物干預后，各治療組大鼠較模型對照組完整心肌細胞增多，局部可見新生血管排布，膠原纖維不同程度減少，其中蔥白大劑量組與培哚普利組僅見少量膠原纖維增生，心肌細胞大多完整，心肌纖維化程度較輕(圖2)。通過Image J圖像分析軟件計算各組大鼠心肌CVF，結果假手術組，模型對照組，蔥白小、中、大劑量組和培哚普利組CVF分別為(0.95±0.19)%，(21.02±1.27)%，(14.14±3.43)%，(9.56±0.86)%，(5.71±1.10)%和(5.03±0.92)%。模型對照組較其他組CVF值明顯升高，蔥白提取物各治療組間CVF值隨蔥白治療劑量增加而減少。

2.3各組大鼠心肌TGF-β1、Smad2蛋白表達 與假手術組大鼠相比，模型對照組大鼠心肌細胞內TGF-β1、Smad2表達明顯增加(t=28.992，44.930，P<0.01)；與模型對照組比較，蔥白大劑量組、蔥白中劑量組及培哚普利組TGF-β1、Smad2蛋白表達均下調(t=21.310，27.870，P<0.01)，蔥白提取物抑制作用呈濃度依賴性(P<0.05)；蔥白小劑量組TGF-β1、Smad2表達趨勢有所下調，但與模型對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

2.4RT-CPR結果 與假手術組相比，模型對照組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2表達顯著增加(P<0.01)；藥物干預后，與模型對照組相比，蔥白大、中、小劑量組和培哚普利組均可抑制心肌梗死大鼠心肌中TGF-β1、Smad2的表達(P<0.05)，其中蔥白大劑量組和培哚普利組抑制作用顯著，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，蔥白提取物的抑制作用呈濃度依賴性(圖4)。

A.假手術組；B.模型對照組；C.蔥白小劑量組；D.蔥白中劑量組；E.蔥白大劑量組；F.培哚普利組。

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.

Fig.1HEstainingresultsofsixgroupsofrathearttissue(×400)

A.假手術組；B.模型對照組；C.蔥白小劑量組；D.蔥白中劑量組；E.蔥白大劑量組；F.培哚普利組。藍色區(qū)域為纖維化區(qū)域。

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.The blue area indicates fibrosis.

Fig.2Massonstainingontheheartsofsixgroupsofrats(×100)

A.假手術組；B.模型對照組；C.蔥白小劑量組；D.蔥白中劑量組；E.蔥白大劑量組；F.培哚普利組；①與假手術組比較，t=21.310，27.870，P<0.01；②與模型對照組比較，t=28.990，44.930，P<0.01。

圖3 6組大鼠心臟組織中TGF-β1、Smad2蛋白表達(n=3)

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.①Compared with sham operation group，t=21.310，27.870，P<0.01；② Compared with the model control group，t=28.990，44.930，P<0.01.

Fig.3TheproteinexpressionofTGF-β1andSmad2proteinsintheheartsofsixgroupsofrats(n=3)

3 討論

心肌纖維化是心肌梗死后心功能下降的主要原因，表現(xiàn)為心肌細胞大量壞死，膠原纖維在間質中過量聚集，細胞外基質各型比例失調，心肌組織排列紊亂，導致心室重構，心臟收縮能力下降和順應性降低，從而導致心功能失調甚至心力衰竭。心肌纖維化的形成機制非常復雜，心肌梗死后往往伴隨一系列的炎癥反應，這些炎癥反應在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[7]。胡爽等[8]提出，多種炎癥細胞因子，如IL家族、TNF-α等可通過局部損傷、炎癥反應形式，誘導心肌纖維細胞增生，導致心肌纖維化，抑制炎癥反應可減輕心肌纖維化。本實驗研究表明，蔥白提取物可降低TNF-α和IL-6在心肌梗死后大鼠血液中的含量，從而減少氧化應激和調節(jié)炎癥遞質，改善心臟功能和抑制心肌纖維化，HE染色和Masson染色結果可見藥物干預后，心肌梗死后大鼠心肌組織中炎癥細胞浸潤減少，心肌纖維化程度降低。

A.假手術組；B.模型對照組；C.蔥白小劑量組；D.蔥白中劑量組；E.蔥白大劑量組；F.培哚普利組。①與假手術組比較，t=15.900，36.340，P<0.01；②與模型對照組比較，t=4.852，21.840，P<0.05；③與蔥白小劑量組比較，t=5.334，11.600，P<0.05；④與蔥白中劑量組比較，t=9.954，6.230，P<0.05。

圖4 6組大鼠心肌TGF-β1、Smad2 mRNA表達(n=3)

A.sham operation group；B.model control group；C.low-dose group of Allium Stalk；D.medium-dose group of Allium Stalk；E.high-dose group of Allium Stalk；F.perindopril group.①Compared with the sham operation group，t=15.900，36.340，P<0.01；②Compared with the model control group，t=4.852，21.840，P<0.05；③Compared with the low-dose Allium Stalk group，t=5.334，11.600，P<0.05；④Compared with the medium-dose Allium Stalk group，t=9.954，6.230，P<0.05.

Fig.4ThemRNAexpressionsofTGF-β1andSmad2inmyocardiuminsixgroupsofrats(n=3)

在眾多信號傳導通路中，TGF-β1/Smads通路是公認的介導器官纖維化的信號轉導通路。TGF-β1發(fā)揮生物學效應，是通過Smad 蛋白介導細胞內的信號傳遞，誘導細胞內Smad2和Smad3表達上調，導致心肌細胞外基質產(chǎn)生和沉積，膠原纖維過量聚集促進心肌纖維化[9]。近年來的研究表明，單味中藥或復方中藥在抑制TGF-β1/Smads通路，抑制心肌纖維化方面有一定的作用[10]。向家培等[11]研究表明參松養(yǎng)心膠囊就可調低Smad3的表達，減少Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達量，從而抑制心肌纖維化。中醫(yī)認為陽氣虛衰則無力鼓動血脈，氣血運行不暢則氣滯血瘀；陽虛則寒，溫煦、氣化失司，則水飲內聚，上凌心脈，故心力衰竭可從溫通經(jīng)脈入手治療[12]。蔥白，辛溫，具有發(fā)表、散血、通陽的功效，既往研究證明蔥白提取物可抑制Ⅰ型膠原蛋白的表達，延緩Ⅲ型膠原蛋白的降解，降低Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的比例，抑制心肌纖維化[13]。本研究表明蔥白提取物可降低心肌梗死大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2蛋白表達量，細胞外基質產(chǎn)生和沉積減少，心肌纖維化程度減輕，其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smads通路的信號傳導有關。實驗表明各劑量組BNP明顯降低，呈現(xiàn)劑量依賴效應，說明蔥白提取物能改善大鼠心功能，這種作用可能與其抑制心肌纖維化有關。

綜上所述，蔥白提取物可改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心功能，減輕和延緩心肌纖維化的進程，其機制可能是通過抑制炎癥反應和降低心肌TGF-β1、Smad2蛋白的表達來實現(xiàn)的。