精胺普魯蘭-siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞方法的研究

萬(wàn) 嚴(yán)，劉 紅，趙 昀，馬文娟

（1.蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006）

白血病是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。雖然，隨著科技和醫(yī)療水平的發(fā)展，其診療方法得到很大的改善，但仍有大量患者面臨復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，因此，尋找有效治療方案依然是該疾病目前需要解決的難題。為了更有效地治療白血病，仍需闡明該疾病的細(xì)胞與分子致病機(jī)制，而白血病細(xì)胞普遍難以轉(zhuǎn)染，因此需要尋找有效的遞送載體以促進(jìn)白血病致病機(jī)制的探索。小干擾RNA（siRNAs）是短的雙鏈核酸，它特異性地抑制靶基因表達(dá)并阻止特定蛋白質(zhì)的合成[3]，可以在研究白血病細(xì)胞與分子致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外，白血病干細(xì)胞及靜息期（G0）細(xì)胞被認(rèn)為是該疾病維持和產(chǎn)生抗藥性的原因，所以根除白血病干細(xì)胞及G0期細(xì)胞對(duì)于疾病的治療至關(guān)重要[4-6]。因此，能有效遞送siRNA進(jìn)行白血病細(xì)胞，包括干/祖細(xì)胞或G0期細(xì)胞的方法將有利于白血病致病機(jī)制的探索。

體內(nèi)遞送siRNA到靶組織是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。目前，可以用病毒和非病毒載體將siRNA遞送至細(xì)胞。病毒載體能夠較非病毒載體實(shí)現(xiàn)更有效的基因遞送；但病毒載體可能會(huì)引起插入突變，具有致癌作用并引發(fā)免疫反應(yīng)[5]。非病毒載體遞送效率較低，但也具有其自身優(yōu)勢(shì)，例如分子組成的精確控制，改性后的多功能性及載體尺寸的耐受性[7-8]。許多文獻(xiàn)報(bào)道使用陽(yáng)離子載體和穿透肽將siRNA遞送到各種細(xì)胞[9-10]，包括來(lái)自黑酵母的非離子多糖普魯蘭（pullulan）。由于普魯蘭的無(wú)毒、無(wú)免疫原性、非誘變性和非致癌性的特性，它已被開(kāi)發(fā)為新型基因遞送載體[11]。它可以被包括精胺在內(nèi)的多種材料修飾，能夠?qū)①|(zhì)粒DNA和siRNA傳遞至多種細(xì)胞中[12-13]；本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明以精胺普魯蘭（spermine-introduced pullulan, Ps）為載體，可有效遞送miRNA至慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）干/祖細(xì)胞中[14]。然而，該載體能否也應(yīng)用于siRNA的遞送，以及該方法能否適用于更多種類的白血病細(xì)胞和特殊狀態(tài)的白血病細(xì)胞（比如，靜息期干/祖細(xì)胞）都值得繼續(xù)探討。

本文將詳細(xì)介紹如何利用Ps遞送siRNA到白血病細(xì)胞，包括靜息期的白血病干/祖細(xì)胞。該方法有望為進(jìn)一步系統(tǒng)研究白血病細(xì)胞與分子致病機(jī)制及治療策略提供新工具。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞 人CML細(xì)胞株K562、人急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞Hut78、人B細(xì)胞淋巴瘤（B-cell lymphoma）細(xì)胞Raji購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞庫(kù)，人急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）細(xì)胞株SHI-1由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院陳蘇寧教授饋贈(zèng)，CML患者骨髓樣本由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科提供。使用含有10%胎牛血清（56 ℃滅活30 min）的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)上述各種細(xì)胞株；利用含有細(xì)胞因子的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓樣本，培養(yǎng)基中含有20% BIT、1% β-巰基乙醇、1%谷氨酸、100 ng/mL SCF、100 ng/mL FLT-3L、20 ng/mL G-CSF、20 ng/mL IL-3和20 ng/mL IL-6。細(xì)胞在含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.2 Ps轉(zhuǎn)染siRNA Ps由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院劉健研究員和許海燕教授饋贈(zèng)[13]。使用DEPC水溶解Ps粉末，配制濃度為250 μg/mL的母液，經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后，置4 ℃?zhèn)溆?。將訂?gòu)于上海吉瑪生物科技有限公司的siRNA用DEPC水配制成20 μmol/L的母液。實(shí)驗(yàn)前取一定量的Ps和siRNA混勻，并加DEPC水補(bǔ)至50 μL，室溫放置15 min。將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用1×PBS洗2 遍，用Opti-MEM培養(yǎng)基重懸（1×105個(gè)/mL）。將1 mL細(xì)胞重懸液（1×105個(gè)）置于1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中（24孔培養(yǎng)板），并加入預(yù)制好的Ps-siRNA的混合液（50 μL），孵育6 h后用1×PBS洗2 遍，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種在96孔板（1×104個(gè)/200 μL）中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，在每個(gè)孔中加入CCK-8（Cell Counting Kit-8，Beyotime，Shanghai，China）試劑（10 μL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）檢測(cè)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry） 收集3×105個(gè)經(jīng)Ps-siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，1×PBS洗2 次后，用500 μL PBS重懸細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀（CaliburTM，Becton-Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA）檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.5 靜息期細(xì)胞的分離 在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)CML患者細(xì)胞過(guò)夜。第二天清洗細(xì)胞，并在含有2%FBS的Hank'緩沖液中加入Hoechst 33342（Hst，10 mmol/L），37 ℃避光、溫浴45 min，再加入Pyronin Y（Py，2.5 mg/mL）溫浴45 min，最后使用CD34-APC抗體和PI（1 mg/mL）染色細(xì)胞20 min。而后，使用FACS分離HstloPyloCD34+細(xì)胞（G0細(xì)胞）和Hstlo/hiPyhiCD34+細(xì)胞（G1/S/G2細(xì)胞）。

2 結(jié)果

2.1 利用K562和Raji細(xì)胞檢測(cè)Ps-siRNA復(fù)合物的毒性將配置好的siRNA（1.06 μg）與不同量的Ps（結(jié)構(gòu)如圖1A，范圍0.625～7.5 μg）混合以形成復(fù)合物（N/P范圍為0.6～7.2），然后將這些復(fù)合物與K562和Raji細(xì)胞共同孵育，24 h后檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，K562和Raji細(xì)胞的IC50分別為2.45和2.5 μg Ps，即N/P值分別為2.35和2.4。并且，當(dāng)Ps為1.25 μg時(shí)，K562和Raji細(xì)胞的活性都在90%以上（圖1，見(jiàn)封二）。

2.2 不同劑量的Ps對(duì)遞送效果的影響 為檢測(cè)Ps劑量對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染效率的影響，根據(jù)毒性檢測(cè)結(jié)果，分別選取0.625、1.25和1.875 μg的Ps與FAM標(biāo)記的siRNA混合（1.06 μg），然后對(duì)K562、SHI-1、Hut78和Raji等白血病/淋巴瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，siRNA量不變時(shí)，轉(zhuǎn)染效率和熒光強(qiáng)度隨著Ps的增加而增強(qiáng)（圖2）。

圖2 不同劑量的Ps對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染效率的影響Fig.2 Effects of Ps amount on the delivery of Ps-siRNA nanoparticles to various leukemic cells

2.3 不同劑量siRNA對(duì)遞送效率的影響 為了進(jìn)一步檢測(cè)不同劑量siRNA對(duì)遞送效率的影響，我們固定Ps的劑量與不同劑量的siRNA混合，然后檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。從圖2可以看出1.875 μg的Ps轉(zhuǎn)染效率高于90%，但是該劑量對(duì)細(xì)胞毒性比較大，而Ps為1.25 μg時(shí)，細(xì)胞活性在90%以上，轉(zhuǎn)染效率在80%以上。于是，我們固定Ps的劑量為1.25 μg，分別與不同劑量siRNA（0.13～2.67 μg）混合，孵育6 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示：當(dāng)加入1.06和1.34 μg的siRNA時(shí)，具有較好的轉(zhuǎn)染效率。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取1.06 μg的siRNA和1.25 μg的Ps為最佳劑量，即N/P＝1.2（圖3，見(jiàn)封二）。

2.4 Ps-siRNA能有效抑制白血病細(xì)胞中靶基因的表達(dá) 為驗(yàn)證Ps-siRNA復(fù)合物在攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞后能抑制靶基因的表達(dá)，以K562細(xì)胞為模型，對(duì)靶向ID2的siRNA進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后的2～8 d內(nèi)，ID2的mRNA表達(dá)都受到顯著抑制；Western檢測(cè)則顯示轉(zhuǎn)染后2～4 d時(shí)ID2蛋白表達(dá)受到顯著抑制，但第8天時(shí)ID2的表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞幾乎一致。這表明Ps-siRNA復(fù)合物在轉(zhuǎn)染后2～4 d能有效地抑制靶基因的表達(dá)（圖4）。

圖4 Ps-siRNA復(fù)合物對(duì)K562細(xì)胞中ID2表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Ps-siRNA nanoparticles on ID2 expression in K562 cells

2.5 Ps-siRNA可以有效轉(zhuǎn)染靜息期白血病細(xì)胞 靜息期細(xì)胞是指暫時(shí)脫離了細(xì)胞周期，停止分裂的細(xì)胞，一旦收到信號(hào)刺激，會(huì)很快返回細(xì)胞周期進(jìn)行分裂和增殖的一個(gè)細(xì)胞群落。白血病的復(fù)發(fā)與處于靜息態(tài)的干/祖細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。

選取K562細(xì)胞為模型，研究Ps-siRNA復(fù)合物對(duì)處于不同細(xì)胞周期狀態(tài)中細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力。使用Hochest/Py的染色方法，分離處于G0和G1/S/G2期的K562細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PssiRNA復(fù)合物可以有效地轉(zhuǎn)染未經(jīng)處理、G0和G1/S/G2期的K562細(xì)胞（圖5）。

圖5 Ps-siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染處于不同周期狀態(tài)的K562細(xì)胞Fig.5 Ps-siRNA nanoparticles effectively transfect K562 cells in various cell-cycle stages

而后，使用相同條件轉(zhuǎn)染CML患者處于不同細(xì)胞周期的CD34+細(xì)胞。結(jié)果顯示，Ps-siRNA復(fù)合物也能有效地轉(zhuǎn)染各類CML患者CD34+細(xì)胞（圖6）。

圖6 Ps-siRNA能有效轉(zhuǎn)染CML干/祖細(xì)胞及靜息期細(xì)胞Fig.6 Ps-siRNA nanoparticles effectively transfect CML CD34+ and subsets of these cells in different cell-cycle stages.

3 討論

我們的研究顯示Ps-siRNA在N/P值為1.2時(shí)，不影響細(xì)胞活性。雖然，已有報(bào)道證實(shí)普魯蘭可以遞送DNA和siRNA到不同類型的細(xì)胞中，但是普魯蘭作為遞送工具遞送siRNA到白血病細(xì)胞，尤其是比較難以轉(zhuǎn)染的白血病干/祖細(xì)胞及處于靜息態(tài)細(xì)胞的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。我們的研究顯示Ps-siRNA復(fù)合物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種不同類型的白血病細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，而且在轉(zhuǎn)染后2～4 d內(nèi)能有效抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達(dá)，為各類研究提供了實(shí)驗(yàn)窗口。另外，該復(fù)合物還能高效地轉(zhuǎn)染患者來(lái)源的干/祖細(xì)胞。以CML為例，我們的數(shù)據(jù)表明超80%的患者CD34+細(xì)胞可被轉(zhuǎn)染；另外，處于靜息期的CD34+細(xì)胞也可獲得類似的轉(zhuǎn)染效率。這是對(duì)我們前期工作的重要延展[14]。

綜上，我們的研究為在實(shí)驗(yàn)研究中向多種白血病細(xì)胞遞送siRNA提供了一個(gè)簡(jiǎn)潔（轉(zhuǎn)染過(guò)程僅6 h）而高效（針對(duì)患者CD34+細(xì)胞＞80%）的瞬時(shí)基因遞送方法。它有望為白血病發(fā)病機(jī)制的研究、特異治療靶標(biāo)的鑒定等工作提供有力的研究工具。