丁苯酞對慢性酒精中毒大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的影響

董家行 姜萬舉 劉佳聰 朱甲婧 張占蕊 張瑞嶺 杜愛林

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室 中英腦功能損傷聯(lián)合實驗室 河南省高校腦研究重點實驗室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 河南省生物精神病學(xué)重點實驗室)

慢性酒精中毒在全世界許多國家都是一個社會性健康難題，據(jù)調(diào)查，我國約4.7%的成年居民存在過量飲酒的狀況，很多地區(qū)都存在著酒精濫用的現(xiàn)象，對社會生產(chǎn)力的穩(wěn)定發(fā)展造成了較大的威脅〔1〕。慢性酒精中毒患者會出現(xiàn)需要飲酒的強迫性體驗，而在停止飲酒后，往往容易出現(xiàn)戒斷綜合征?；颊邥r常會惡心、嘔吐、心中難受，甚至?xí)憩F(xiàn)出肢體震顫等軀體疾病，然而這些癥狀在飲酒后則會自行消除，同時會出現(xiàn)幻覺、妄想及相應(yīng)的情緒和行為異常,易有攻擊或暴力行為,甚至自殺。有報告指出，酒精中毒者的自殺率比一般人群高2～4倍,10%～15%的嗜酒者有自殺行為〔2,3〕。此外，長期不良的飲酒嗜好能夠促進各類軀體及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，讓患者難以適應(yīng)社會,人際關(guān)系緊張,更易失業(yè),使經(jīng)濟更加困難。有關(guān)研究表明慢性酒精中毒可導(dǎo)致大腦萎縮〔4，5〕，過量酒精會損傷記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，如海馬區(qū)、前額葉皮層等，導(dǎo)致慢性神經(jīng)炎癥的發(fā)生、神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)減少及神經(jīng)毒性物質(zhì)釋放，進而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡〔6，7〕。而目前的科學(xué)研究水平針對這種病尚無良好的藥物來進行治療。近年來，對慢性酒精中毒性引發(fā)的大腦神經(jīng)退行性疾病的病理研究，為慢性酒精中毒后的生物信息學(xué)研究及發(fā)展打下了堅實的基礎(chǔ)。丁苯酞(NBP)是中國自主研發(fā)出的抗缺血性腦卒中藥物。研究證明NBP可通過提高腦血管內(nèi)皮一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI)2的水平，抑制谷氨酸釋放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基活性等機制對腦缺血產(chǎn)生治療效果〔8〕。NBP能影響海馬內(nèi)硫化氫(H2S)及CA1、CA3區(qū)5羥色胺(HT)表達(dá)量進而改善慢性酒精中毒癥狀〔9〕。動物藥效學(xué)研究表明,NBP抗腦缺血效果良好，能夠增加缺血區(qū)毛細(xì)血管數(shù)量，顯著改善腦區(qū)的微循環(huán)，減輕腦水腫,縮小大鼠局部腦缺血的梗死面積〔10〕。研究表明，NBP可改善線粒體功能和促進腦能量代謝,抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，抑制血栓形成等〔11〕。因此推測,NBP可能對慢性酒精中毒導(dǎo)致的神經(jīng)功能損傷有改善作用,可促進患者功能恢復(fù)。本實驗基于NBP干預(yù)后慢性酒精中毒大鼠大腦海馬的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，結(jié)合了生物信息學(xué)的分析方法，篩選出差異表達(dá)基因，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)對關(guān)鍵mRNA的表達(dá)進行驗證。試圖從基因?qū)哟翁接慛BP對慢性酒精中毒的影響及其改善機制。

1 材料與儀器

1.1實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠36只，由鄭州大學(xué)動物中心提供。實驗動物隨機分為正常組、模型組和用藥組各12只。喂養(yǎng)4 w后，統(tǒng)一處死，取大腦海馬區(qū)組織。正常組喂養(yǎng)蒸餾水，用植物油進行灌胃。模型組喂養(yǎng)6%的酒精溶液4 w，并用植物油進行灌胃，造成慢性酒精中毒；而用藥組也喂養(yǎng)6%的酒精溶液，前2 w用等量的植物油進行灌胃，后 2 w則用等量的植物油稀釋過的NBP 20 mg/kg進行灌胃。

1.2儀器與試劑 主要試劑耗材為Illumina Gene Expression Sample Prep Kit和Solexa測序芯片(flowcell)，主要儀器是Illumina Cluster Station和Illumina HiSeqTM2000系統(tǒng)，均來源于華大基因公司。BNP(批號：118170424)購于石藥集團恩比普藥業(yè)有限公司。

Morris水迷宮是由圓形水池、隱藏于水面之下的可移動平臺、圖像自動采集和處理分析系統(tǒng)組成。圓形水池直徑為150 cm,高50 cm，以池壁上的4個等距離點劃分為4個象限(東北，東南，西南，西北)，每個象限池壁圓弧中點為大鼠入水點，平臺放置于SW象限中心，并沒入水面以下2 cm。圖像自動采集和處理分析系統(tǒng)記錄動物游泳軌跡數(shù)據(jù)用于指標(biāo)的提取及分析。實驗恒定，水溫控制在25℃，在水池周圍安放藍(lán)色不透光布簾保證水池水面光線均一，實驗期間保證環(huán)境的安靜。

1.3定位航行實驗 定位航行實驗?zāi)軌蛴行z測出實驗動物在水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶能力。實驗開始前30 min將大鼠置水迷宮所在房間以適應(yīng)環(huán)境，將大鼠用手托起令其面向池壁，以半隨機方式選擇入水點輕輕放入水中，每天每只訓(xùn)練 4 次，4個不同象限各1次，實驗進行4 d，每只共計訓(xùn)練16次。若在60 s內(nèi)登陸上平臺，則將其搜尋并登上平臺花費的時間作為潛伏期。反之，實驗者則需要將其引導(dǎo)至平臺，同時要將潛伏期記錄為60 s。待登陸平臺后，讓其在平臺上停留30 s。每天實驗后及時統(tǒng)計并計算各組游泳距離、潛伏期和平均游泳速度。

1.4芯片數(shù)據(jù)處理及差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選 處死大鼠后，每組6只完整取出大腦海馬組織，并快速放入液氮中保存。提取出海馬中的RNA，使Illumina基因表達(dá)的樣品試劑盒和Solexa測序芯片對模型組及用藥組的海馬基因表達(dá)進行檢測，并獲取相應(yīng)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集。借助基因芯片獲取了原始的慢性酒精中毒大鼠海馬基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，之后對該數(shù)據(jù)集進行一系列預(yù)處理，并參照Audic〔12〕的數(shù)字化基因表達(dá)譜差異基因檢測方法，篩選出了最終的差異表達(dá)基因的數(shù)據(jù)。

1.5基因功能顯著性富集分析 基因本體(GO)能夠?qū)Σ町惐磉_(dá)基因進行功能分類，它可從分子功能、細(xì)胞組成和生物活動過程等3個層面對目標(biāo)基因進行詳細(xì)的描述。在獲取海馬mRNA的表達(dá)譜后，借助GO體系對DEGs進行精準(zhǔn)注釋，并進一步做富集化分析，最終得到所有差異基因中明顯富集的所有分類條目，方便對慢性酒精中毒后轉(zhuǎn)錄組學(xué)進行深入的研究。

1.6信號通路顯著性富集分析 京都基因與基因組百科(KEGG)數(shù)據(jù)庫可以快速查詢到基因所在通路的詳細(xì)信息，包括其代謝途徑、所處的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、產(chǎn)物及相互作用的基因等信息，幫助研究者高效地定位具體的研究方向。同時還可以對未知的序列比對(BLAST)序列進行比對，找出具體代謝途徑，迅速定位某段序列所處的通路，其功能很強大，數(shù)據(jù)覆蓋廣泛。借助KEGG對所有差異表達(dá)基因進行信號通路富集分析，將得到的詳細(xì)的通路富集信息表讀取到R語言中，加載并運行專業(yè)用于科研繪圖的ggplot2包，將信號通路條目作為縱坐標(biāo)，把各個轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集的P值作為橫坐標(biāo)，繪制出一張詳細(xì)的信號通信富集氣泡圖。在該氣泡圖中，各個通路代表的氣泡越接近縱坐標(biāo)軸，即表明其結(jié)果可信度越高；氣泡越大則代表信號通路中所包含的差異基因的總數(shù)越多；顏色越偏向紅色則顯示該條信號通路的富集程度更高。

1.7蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析(STRING)數(shù)據(jù)庫囊括了大量的蛋白質(zhì)功能信息，并且能夠精準(zhǔn)比對未知的BLAST序列，給出其詳盡的功能簡介。且該數(shù)據(jù)庫還可以對不同的蛋白質(zhì)之間直接或間接功能的相關(guān)性進行查詢，支持對目標(biāo)蛋白質(zhì)和未知蛋白質(zhì)之間是否存在相應(yīng)的作用方式展開預(yù)測，可以有效地幫助研究者對獲取的差異基因表達(dá)譜及蛋白間互作方式進行綜合研究。借助STRING數(shù)據(jù)庫研究蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，并將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape，使用MCODE插件對其子網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析。

1.8qPCR檢測關(guān)鍵基因的表達(dá)量 完整取出大鼠的海馬體組織，從兩組中各篩選出3個樣本進行qPCR實驗，用1 ml TRIzol制備勻漿，提取總RNA，測定其純度及濃度，按試劑盒要求進行反轉(zhuǎn)錄操作，并進行PCR擴增。實時熒光定量PCR體系由20 μl的反應(yīng)體系組成：SYBR(20×) 0.3 μl，Platinum?Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.2 μl，ddH2O 14 μl，10×PCR緩沖液(-)2 μl，Mg2+(50 mmol/L)1 μl，dNTPs(10 mmol/L) 0.5 μl，正義鏈(10 mol/L) 0.5 μl，反義鏈(10 mol/L)0.5 μl，Template(就是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,也即cDNA)1 μl。反應(yīng)中的Ct值數(shù)據(jù)的采集采用校正的閾值設(shè)定，實時熒光定量PCR 的方法以β-肌動蛋白(ACTB)作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法進行相對定量。 擴增條件為：95℃ 60 s，95℃ 5 s，60℃ 40 s，反應(yīng)40個循環(huán)，引物序列：SEC61g上游：5′-GGACTCGATTCGGCTGGTTA-3′，下游：5′-GCCGATGAACCCCATGATAG-3′；NDUFA4上游：5′-TGCAGGAGCACCTGAGTCAGT-3′，下游：5′-CAAGGAAGGCACCGGATCT-3′；NDUFA2上游：5′-CAACGGTACGTGGAGCTGAA-3′，下游：5′-ACCTCAGCAGCACTCAGATTGT-3′。

2 結(jié) 果

2.1模型組與正常組學(xué)習(xí)記憶功能的對比 第1天，兩組平臺潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；第2～4天模型組平臺潛伏期顯著延長(P<0.001)，提示模型組學(xué)習(xí)記憶能力受到損傷。見表1。

表1 正常組與模型組水迷宮平臺潛伏期的 比較

與正常組比較：1)P<0.001

2.2數(shù)據(jù)預(yù)處理及DEGs的篩選 對芯片數(shù)據(jù)進行相應(yīng)的處理后，與模型組相比，用藥組共585個DEGs。320個基因表達(dá)上調(diào)，265個基因表達(dá)下調(diào)。模型組與用藥組相比有208個DEGs。

2.3差異基因的GO富集分析和通路分析 選取富集程度較高的前10個GO條目進行分析。用藥組與模型組之間對比，GO富集的生物學(xué)過程分析表明差異基因主要涉及膜去極化調(diào)節(jié),磷酸鹽代謝過程，磷的代謝過程,生物過程調(diào)節(jié)，生物調(diào)節(jié)，抗原刺激的炎癥反應(yīng),Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的正調(diào)控作用，細(xì)胞代謝過程,C4二羧酸轉(zhuǎn)運等生物學(xué)過程，見表2；分子功能表明，DEGs主要涉及催化活性,作用于酯鍵的水解酶活性,磷蛋白磷酸酶的活性,二羧酸的跨膜轉(zhuǎn)運活性,(醌)活性，磷酸酶的活性,酸性氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運活性,蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，陽離子：糖轉(zhuǎn)運體活性，水解酶活性等功能，見表3。KEGG富集分析結(jié)果見圖1，富集程度最高的前10條信號通路主要與氧化磷酸化通路,黏合連接,蛋白酶體通路,脂肪細(xì)胞因子信號通路,絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,破骨細(xì)胞的分化,黏著，幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),帕金森病通路,聚酮糖的生物合成等信號通路相關(guān)。表4、5是參與細(xì)胞信號通路中的DEGs。

表2 差異基因涉及的生物過程

表3 差異基因涉及的分子功能

圖1 信號通路富集

2.4差異基因編碼蛋白的相互作用分析 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖中的線代表兩個蛋白之間有相互作用關(guān)系，而線的數(shù)量記作度。對這些差異表達(dá)基因進行了進一步的篩選。模型組相比正常組出現(xiàn)差異表達(dá)的208個基因，用藥組相比模型組發(fā)生差異表達(dá)的585個基因，取了一個交集。共獲得了107個DEGs，這107個差異表達(dá)基因就是大鼠在慢性酒精中毒以后出現(xiàn)差異表達(dá)，而后又經(jīng)過NBP治療被反向調(diào)控的。提示NBP可能通過調(diào)控這107個基因?qū)β跃凭卸緭p傷起到了一定的保護作用。

表4 差異基因涉及的信號通路富集分析〔n(%)〕

表5 富集程度最高的前10條通路中所參與的差異基因

隨后在STRING數(shù)據(jù)庫在線系統(tǒng)上讀取了107個DEGs的基本信息，并運行相應(yīng)的預(yù)測工具，結(jié)果顯示僅102個基因能在數(shù)據(jù)庫中搜到相對應(yīng)的信息，在得到初步的蛋白互作圖后，將孤立的蛋白除去，并將數(shù)據(jù)表格導(dǎo)出(見圖2)，再將其導(dǎo)入到Cytoscape軟件中進行可視化操作及中心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點分析，再排除degree為1且分散的局部蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，才得到最終的中心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，同時借助MCODE插件分析出最重要的2個子網(wǎng)絡(luò)(見圖4)。其中RPSA、RPS9、RPS11、SRP19、sec61G、EIF3E、LARS、Ndufa4、Ndufb6、Ndufa2等是與周圍蛋白相互作用最密集的前10個蛋白，屬于該相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心蛋白(見表6)，刪除這些中心蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散。

圖2 差異基因編碼蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 中心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 最重要的2個子網(wǎng)絡(luò)

2.5關(guān)鍵mRNA的相對表達(dá)量 對Sec61g、Ndufa4、Ndufa2等關(guān)鍵基因進行檢測，慢性酒精中毒以后，這3個與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體相關(guān)的mRNA表達(dá)量顯著降低，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體出現(xiàn)了一定的損傷。然而與模型組相比，用藥組海馬體內(nèi)的Sec61g、Ndufa4、Ndufa2的相對表達(dá)量有較為顯著提高(P<0.05或P<0.01)，見表7。提示BNP可能對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體損傷的修復(fù)作用。使用GraphPad Prism對以上結(jié)果進行處理。

表6 PPI網(wǎng)絡(luò)中心蛋白

表7 Ndufa2、Ndufa4和Sec61g mRNA的 相對表達(dá)量

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

3 討 論

易位通道是新生的肽鏈在共翻譯轉(zhuǎn)運時所經(jīng)過的通道。由于N端帶有正電荷，新生的肽鏈無法輕易地進入表面疏水的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，所以需要借助1個蛋白引導(dǎo)通道才能進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而完成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運，這樣的通道就是易位通道。

Sec61異源三聚體，包含α、β和γ 3個亞基。在真核生物中，Sec61異源三聚體就是易位通道的核心。它的主要作用是能夠形成一個疏水通道，從而幫助新生的肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Sec61復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白與核糖體共同的作用才能形成易位通道。通過Sec61和易位子相關(guān)蛋白(TRAP)結(jié)合，為分泌蛋白和膜蛋白轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運提供便利。然而慢性酒精中毒以后Sec61γ的表達(dá)下調(diào)可能影響與TRAP組成的復(fù)合體的活性導(dǎo)致蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)滯留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶基因表達(dá)激活，并引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(UPR)〔13〕，損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能。 UPR 主要由3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜受體介導(dǎo)：肌醇需求酶(IRE)1、PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)6。一方面，UPR能夠減少蛋白質(zhì)的合成從而使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕，在有限程度上降低甚至消除蛋白質(zhì)的折疊給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)帶來的負(fù)荷。另一方面，由于前者的調(diào)節(jié)是有限的，隨著蛋白質(zhì)的過度積累和鈣穩(wěn)態(tài)的進一步失衡，UPR將無法修復(fù)細(xì)胞損傷并引起細(xì)胞凋亡，即由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。另外，細(xì)胞還可啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白質(zhì)降解途徑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)從而清除折疊錯誤的蛋白質(zhì)〔14〕，然而持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過 UPR 激活凋亡信號通路，這可能與阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生機制有關(guān)，并且已被實驗證實〔15～18〕。當(dāng)UPR不足以使細(xì)胞對抗應(yīng)激時，CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的促凋亡因子表達(dá)增加caspase12活化并激活下游caspase3，最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生。且GO富集顯示，差異表達(dá)基因主要與膜磷脂的代謝過程相關(guān)，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能出現(xiàn)了損傷。在本實驗中，慢性酒精中毒經(jīng)過BNP治療以后Sec61γ的表達(dá)又被反向調(diào)控到原始水平，可能在一定程度上修復(fù)了易位通道，促使新生肽鏈的轉(zhuǎn)入和錯誤折疊的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)出，減輕UPR，減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡，qPCR實驗進一步驗證了這種結(jié)果。

此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的破壞，會阻礙鈣離子的攝取和轉(zhuǎn)運，進而影響線粒體的功能〔19，20〕。過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也可能涉及線粒體和細(xì)胞色素C的協(xié)同作用，從而激活caspase和細(xì)胞凋亡。而在本研究中，芯片數(shù)據(jù)顯示慢性酒精中毒以后Cox6c表達(dá)上調(diào)，提示線粒體復(fù)合體Ⅰ的損傷可能與UPR有關(guān)。據(jù)Rizzuto等〔21〕的研究，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間存在很多密切關(guān)系，它們可以通過膜交換鈣離子、脂質(zhì)和糖化蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1，4，5-三磷酸肌醇(InsP3)/Ca2+通道的開放能影響到線粒體中鈣離子的平衡，也是caspase3作用的靶標(biāo)之一〔22，23〕。由此可見，慢性酒精中毒會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的損害。

通過KEGG聚類分析顯示，慢性酒精中毒可能與氧化磷酸化通路、阿爾茨海默病信號通路、帕金森病信號通路、亨廷頓病信號通路、D-谷氨酰胺和谷氨酸代謝通路相關(guān)。提示慢性酒精中毒損害可能是阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要因素之一〔24，25〕。慢性酒精中毒可能對海馬的神經(jīng)元造成損傷，進一步損害其學(xué)習(xí)記憶能力。通過上調(diào)Cox6c和Ndufb8，下調(diào)Ndufa2、Ndufa4、Ndufb6等的表達(dá)，從而抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的功能。不僅使機體產(chǎn)生的游離自由基增加，損傷神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，而且還能讓線粒體中的電子傳遞鏈活性被抑制，導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生減少和細(xì)胞損傷〔26〕。此外，Cox6c是細(xì)胞色素C氧化酶的亞基〔27〕，在本研究中異常上調(diào)，也提示著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能涉及線粒體及細(xì)胞色素C的協(xié)同作用而使caspase 激活和細(xì)胞凋亡。然而經(jīng)過BNP治療以后，Ndufa4，Ndufa2又被上調(diào)到正常水平，qPCR實驗進一步驗證了這一結(jié)果。提示BNP對線粒體具有一定的保護作用，可在一定程度上，對慢性酒精中毒起到治療作用。利用生物信息學(xué)的方法能有效地分析基因芯片數(shù)據(jù)，從而高效地獲取生物內(nèi)在信息〔28〕，本研究中差異表達(dá)基因涉及蛋白酶體通路、氧化磷酸化通路等通路，可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積聚的未折疊或錯誤折疊的蛋白的降解及線粒體復(fù)合體的修復(fù)有關(guān)，可能通過這些通路對線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起到一定的保護作用。綜上，通過生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)BNP可以將由慢性酒精中毒造成差異表達(dá)的多個基因反向調(diào)控到正常水平，通過調(diào)控Sec61G、Ndufa4、Ndufa2等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或線粒體相關(guān)基因的表達(dá)，緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕線粒體損傷，在一定程度上保護了神經(jīng)元細(xì)胞。BNP對慢性酒精中毒引起的海馬體損傷具有一定的保護作用。