兩種檢測血型抗體IgG亞型的方法比較

馬印圖, 陳 莉, 張 怡, 董書文, 王振雷, 楊曉亞, 王少文, 李莉華

(1.河北省石家莊市聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八〇醫(yī)院輸血科，河北 石家莊 050082 2.河北省血液中心，河北 石家莊 050071)

新生兒溶血病(hemolytic disease of the newborn，HDN)是由于胎兒與其母親之間血型不相同，胎兒的少量紅細(xì)胞經(jīng)過胎盤出血進(jìn)入母親體內(nèi)，刺激孕婦產(chǎn)生了針對胎兒紅細(xì)胞的血型特異性抗體，這些抗體進(jìn)而破壞胎兒的紅細(xì)胞，引起胎兒和/或新生兒發(fā)生免疫性溶血反應(yīng)，嚴(yán)重者可引起死胎或高膽紅素腦病的嚴(yán)重后果。新生兒溶血的輕重與多種因素有關(guān)，其中與血型抗體IgG亞型有直接關(guān)系。由于檢測方法的差異新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生率在30～60%之間[1]。文獻(xiàn)報(bào)道孕母血液中IgG1和IgG3亞型的含量與新生兒是否發(fā)病密切相關(guān)[2]。我們研究建立了微柱凝膠技術(shù)檢測血型抗體IgG亞型的試驗(yàn)方法，與目前臨床常用的ELISA方法進(jìn)行平行試驗(yàn)，對孕婦及其產(chǎn)后新生兒血液標(biāo)本進(jìn)行了IgG亞型分析，評(píng)價(jià)兩種方法檢測IgG亞型與新生兒溶血病的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料:2018年1月至2018年12月在我院產(chǎn)科檢查的血型抗體高效價(jià)孕婦62例，其中孕婦血型為O型，Rh陽性，丈夫血型為A、B或AB型57例，免疫性抗A(B)效價(jià)≥512；Rh(D)陰性孕婦5例，抗D效價(jià)≥64，孕婦年齡22～41歲，平均(29.5±0.5)歲，無輸血史及藥物過敏史，非近親結(jié)婚，產(chǎn)后有27例新生兒經(jīng)溶血三項(xiàng)試驗(yàn)檢測確診和可疑HDN的血液標(biāo)本也同步進(jìn)行了IgG亞型檢測，對比觀察兩種方法檢測IgG亞型的一致性，分析血型抗體效價(jià)以及IgG各亞型與新生兒溶血病的相關(guān)性。

1.2 方 法

1.2.1 血型單抗試劑、0.2mol/L 2-巰基乙醇液(2-Me)、試劑紅細(xì)胞由上海血液生物醫(yī)藥公司提供, liss/Coombs微柱凝膠卡、專用離心機(jī)、恒溫孵育器由瑞士達(dá)亞美公司生產(chǎn),IgG亞型微柱凝膠檢測卡、專用離心機(jī)、孵育器由江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司提供，ELISA法IgG亞型檢測試劑盒(美國Sigma公司提供)。

1.2.2 血型鑒定、抗體效價(jià)測定和新生兒溶血三項(xiàng)試驗(yàn)(直接抗球蛋白試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)、抗體釋放試驗(yàn))操作和結(jié)果判定均嚴(yán)格按照文獻(xiàn)進(jìn)行[3,4]，對可疑和確診為與血型有關(guān)的HDN及時(shí)通知患兒的主治醫(yī)師。

1.2.3 IgG亞型檢測:MGTA試驗(yàn)方法和步驟按照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]。采集O型孕婦4mL外周血,分離后取血清200ul與等量2-Me于試管中混合，37℃處理30min破壞血清中的IgM類抗體，對處理后血清進(jìn)行倍比稀釋4、8、16、32……，取一張IgG亞型檢測卡，標(biāo)記編號(hào)姓名，在檢測卡上面反應(yīng)孔中分別加入倍比稀釋血清25ul和0.6% 標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞懸液50ul,37℃條件下孵育15min，專用離心機(jī)離心5min,取出檢測卡判讀結(jié)果，同一份樣本進(jìn)行IgG亞型定量分析，采用ELISA方法進(jìn)行平行檢測，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，對兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPPSS 13.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，孕婦IgG抗體亞型及各升高例數(shù)與HDN發(fā)病率的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn),MGTA方法檢測結(jié)果以2為底數(shù)取對數(shù)后與ELISA方法檢測結(jié)果比較采用配對t檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

MGTA檢測方法與ELISA方法之間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性較好，前者操作更加簡便、快速，適合臨床常規(guī)可及的方法。新生兒及其母親體內(nèi)IgG1和IgG3的含量與溶血的嚴(yán)重程度具有明顯的相關(guān)性，特別是IgG1的含量與血型不合HDN密切相關(guān)。

2.1 兩種方法檢測IgG亞型結(jié)果比較:對62例高效價(jià)孕婦采用MGTA法和ELISA方法平行檢測了IgG亞型，孕婦血清中各亞型檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=0.3147,P>0.05，結(jié)果見表1。

表1 兩種方法檢測孕婦血型抗體IgG亞型試驗(yàn)結(jié)果n(%)

注： *與ELISA方法比較，P>0.05

2.2 新生兒IgG亞型與溶血情況:新生兒經(jīng)血清學(xué)溶血三項(xiàng)試驗(yàn)檢測有27例可疑和確診與血型相關(guān)的HDN，采用兩種方法進(jìn)行IgG亞型檢測，其中13例發(fā)生了ABO系統(tǒng)HDN,3例Rh系統(tǒng)HDN，部分患兒表現(xiàn)為多種亞型同時(shí)升高，9例重度HDN患兒實(shí)施了換血治療。兩種方法均檢測出產(chǎn)后溶血新生兒血清中IgG1、IgG3的含量升高, 多數(shù)以IgG1為主,二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示患兒血清中IgG1和IgG3的含量,特別是IgG1的含量與血型不合HDN存在較大的相關(guān)性, 換血的HDN新生兒血清中同時(shí)伴有IgG1和IgG3亞型含量增高，結(jié)果見表2。

表2 新生兒IgG亞型與溶血情況(n)

注： *換血的患兒均檢測到IgG1、IgG3同時(shí)升高

3 討 論

因母嬰血型不合引起的新生兒高膽紅素血癥在臨床上時(shí)有發(fā)生。產(chǎn)后新生兒能否出現(xiàn)高膽紅素血癥除了與血型抗體效價(jià)的高低有關(guān)系外，還與胎盤屏障保護(hù)作用、孕婦自身的免疫狀態(tài)、胎兒營養(yǎng)和耐受能力等多種因素有關(guān)[6,7]，有報(bào)道胎兒溶血輕重與IgG抗體亞型密切相關(guān)[8，9]。在IgG抗體的4個(gè)亞型中IgG1含量最高，其激活補(bǔ)體的能力也最強(qiáng)，而IgG2和IgG4亞型相對較弱。國內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道孕婦血液中血型抗體IgG1和IgG3亞型,特別是IgG1亞型的含量與ABO系統(tǒng)的HDN密切相關(guān)[10，11]。目前，臨床檢測IgG抗體亞型的試驗(yàn)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)，這兩種方法的檢測試劑均為進(jìn)口試劑，存在的不足是反應(yīng)時(shí)間長、操作相對繁瑣、試劑價(jià)格昂貴，不適合普通實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。近年來，臨床輸血試驗(yàn)中已經(jīng)普遍采用微柱凝膠檢測技術(shù)(MGTA)[12]，我們自主研發(fā)了微柱凝膠技術(shù)檢測IgG抗體亞型的試驗(yàn)方法，通過篩選最佳凝膠微粒、在微柱中包被IgG亞型的單抗，對檢測技術(shù)的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性等條件進(jìn)行了優(yōu)化，與流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)進(jìn)行比較和評(píng)價(jià)，成功構(gòu)建了MGTA檢測血型抗體IgG亞型的試驗(yàn)方法，試劑滿足國家關(guān)于微柱凝膠檢測卡的產(chǎn)品技術(shù)要求，并申請了國家專利(專利號(hào)201710386556.2)。本研究采用該技術(shù)與目前臨床常有的ELISA方法平行進(jìn)行了高效價(jià)孕婦血型抗體IgG亞型檢測，二者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈明顯的正相關(guān)。國外文獻(xiàn)報(bào)道，在Rh系統(tǒng)引起的HDN試驗(yàn)中, IgG1是胎兒紅細(xì)胞上致敏的主要抗體，約占溶血患兒總數(shù)的97%，IgG3占3%,并由此判斷IgG1是主要的致病抗體,但病情的進(jìn)展和嚴(yán)重程度與IgG3有關(guān)。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，IgG亞型的含量和臨床表現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道的基本相符。綜上所述，MGTA技術(shù)與ELISA方法兩種試驗(yàn)在檢測血型抗體IgG亞型方面的結(jié)果一致性較好，我們建立的MGTA技術(shù)檢測血型抗體IgG亞型的試驗(yàn)方法簡便、快速、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，一個(gè)小時(shí)即可完成檢測，普通實(shí)驗(yàn)室即可常規(guī)開展，適合臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用，對于早期診斷和干預(yù)治療母嬰血型不合HDN具有重要意義。