血管內(nèi)皮生長因子表達及基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病風險的相關(guān)性

王艷艷, 張靜文, 蔡婭瓊

(1.山東省濟寧市第一人民醫(yī)院產(chǎn)科, 山東 濟寧 272000 2.山東省青島市婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)科, 山東 青島 266000)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是一種在妊娠前糖代謝正?；虼嬖谔悄土肯陆登闆r，在妊娠期出現(xiàn)的高血糖代謝疾病且是妊娠期嚴重的并發(fā)癥之一[1]。近年來，雖然各地的GDM的發(fā)病率存在一定的差異，但是整體上呈現(xiàn)明顯的遞增趨勢。有文獻顯示GDM一方面在一定程度上影響了胎兒的生長發(fā)育，另一方面會引起新生兒低血糖、巨大兒及呼吸困難等不良事件發(fā)生率增高，增加了胎兒死亡和母體分娩損傷等發(fā)生的風險[2]。目前，GDM的發(fā)病機制尚沒有明確的結(jié)論，其發(fā)病原因可能與肥胖、遺傳、胰島素抵抗等因素有關(guān)[3]。大部分GDM產(chǎn)婦在產(chǎn)后糖代謝功能恢復正常，但是仍然存在少部分GDM產(chǎn)婦在產(chǎn)后遠期會發(fā)展為Ⅱ型糖尿病，因此許多科研工作者普遍認為GDM的發(fā)病機制與Ⅱ型糖尿病的發(fā)病機制存在一定的相似之處。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，其參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程。有研究表明，VEGF的基因中存在著多個多態(tài)性位點，其中VEGF-460C/T基因多態(tài)性影響著VEGF的水平且與糖尿病視網(wǎng)膜病變緊密相關(guān)[4]。但是有關(guān)VEGF-460C/T基因多態(tài)性在妊娠期糖尿病中研究甚少?；诖耍狙芯刻接慥EGF-460C/T基因多態(tài)性與GDM風險的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取在2016年2月至2018年2月期間來我院就診的GDM孕婦76例及同期正常健康妊娠孕婦76例進行研究。納入標準：①孕周為24～28周；②符合妊娠期糖尿病的診斷標準；③足月分娩。排除標準：①孕前患有糖尿病患者；②患有嚴重肝腎功能不全、代謝功能障礙及嚴重傳染性疾病等患者；③不配合研究患者。其中GDM孕婦作為觀察組，正常妊娠孕婦作為對照組?；颊吣挲g22～34歲，平均年齡(25.60±3.68)歲；體質(zhì)指數(shù)(body mass Index,BMI)24～28kg/m2，平均(26.33±2.32)kg/m2，分娩孕周37～42周，平均(38.53±1.21)周。本研究獲得我院倫理委員會的批準同意，且患者簽署知情同意書。

1.2 研究方法:在清晨抽取兩組患者的肘靜脈血5mL，其中1mL使用2%的乙二胺四乙酸進行抗凝處理，保存在-20℃的冰箱中，用以提取全血基因組DNA。剩余的4mL進行常規(guī)離心分離血清，同樣保存在-20℃的冰箱中，進行生化指標的測定。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定血清VEGF的水平，其中VEGF試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，多功能酶標儀購自美國PERKIN ELMER公司，操作流程嚴格按照試劑盒說明進行。采用全自動生化分析儀(購自日本東芝公司)測定空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein chesterol，LDL-C)及糖化血紅蛋白。 采用酚-氯仿經(jīng)典方法體外外周血基因組。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性檢測VEGF-460C/T基因多態(tài)性。根據(jù)VEGF基因的核苷酸序列進行設(shè)計各位點的擴增引物，采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)對目的基因片段進行擴增。其中PCR擴增的引物序列：VEGF-460C/T引物，上游：5-CTCTTTTAGCCAGAGCCGGG-3,，下游：5，-TGGCCTTCTCCCCGCTCCGA -C-3，；在PCR反應體系(25μl)中100ng提取的DNA，1.0 IU Taq DNA聚合酶(TaKaKa公司生產(chǎn))，2μl上游及下游引物2×PCR buffer。其中PCR的反應條件：95℃條件下變性6min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，進行30個循環(huán)；最后進行72℃延伸10min。其中限制性內(nèi)切酶BsaHI(購自北京百奧萊博科技有限公司)，NIaⅢ酶切。其中酶切產(chǎn)物進行3%瓊脂糖電泳，采用溴化乙錠染色成像用來判定酶切的基因型。

1.3 觀察指標:記錄兩組孕婦的血清VEGF的水平以及統(tǒng)計VEGF-460C/T基因型及等位基因頻率。

2 結(jié) 果

2.1 兩組孕婦的一般臨床及生化指標比較:觀察組孕婦的FPG、糖化血紅蛋白及VEGF水平顯著高于對照組，但HDL-C水平卻顯著低于對照組(P<0.05)。兩組孕婦在年齡、BMI、新生兒出生體重、TC、TG及LDL-C指標上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組孕婦的一般臨床資料比較

2.2 兩組孕婦VEGF-460C/T基因型及等位基因頻率的比較:兩組孕婦的VEGF-460C/T基因型CC、CT、TT及等位基因C、T分布符合Hardy-Weinberg平衡(觀察組χ2=0.635、對照組χ2=0.056，P>0.05)。觀察組患者的CC基因型及C等位基因頻率(27.63%、51.32%)顯著高于對照組(10.53%、34.87%)(P<0.05)，見表2。

表2 兩組孕婦VEGF-460C/T基因型及等位基因頻率的比較n(%)

2.3 不同基因型孕婦GDM的發(fā)病率比較:CC、CT、TT型孕婦的GDM發(fā)病率分別為72.41(21/29)、49.31%(36/73)及47.50%(19/40)，其中CC型孕婦GDM發(fā)病率顯著高于CT、TT型孕婦(χ2=4.492、χ2=4.283，P<0.05)。

2.4 孕婦發(fā)生GDM的二元Logistic多因素回歸分析:將上述單因素分析中糖化血紅蛋白、FPG、VEGF、HDL-C、VEGF基因型納入到二元Logistic多因素回歸模型中，結(jié)果顯示：血清VEGF水平、HDL-C及VEGF基因多態(tài)性是孕婦發(fā)生GDM獨立危險因素。見表3。

表3 孕婦發(fā)生GDM的二元Logistic多因素回歸分析

3 討 論

GDM是一種妊娠期血糖代謝異常的疾病。在我國，GDM的發(fā)病率為1%～5%，且隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變，近年來，GDM的發(fā)病率逐年升高。GDM不僅影響產(chǎn)婦的身體健康；而且增加了圍生兒不良事件的發(fā)生風險，例如新生兒低血糖癥、呼吸困難及早產(chǎn)等，嚴重影響胎兒的身體健康和發(fā)育。目前，針對GDM的發(fā)病機制尚不明確，認為其可能與胎盤血管調(diào)節(jié)紊亂、分泌胰島素抵抗物質(zhì)及激素調(diào)節(jié)失衡等有關(guān)。目前，肥胖、遺傳、胰島素抵抗等因素是妊娠期婦女發(fā)生GDM的重要影響因素。并且妊娠在一定程度上會使隱性的糖尿病顯性化，是未患糖尿病的孕婦發(fā)生GDM,增加了既往糖尿病患者的病情。因此，采取有效措施進行預防，可以降低GDM的發(fā)生率。

隨著臨床對VEGF研究的深入，發(fā)現(xiàn)不同糖尿病患者循環(huán)VEGF水平存在著明顯的差異，并且在血小板被激活破壞的過程中，大量的VEGF被釋放，使得血清的VEGF水平遠遠高于血漿[5]。Zorena K等研究[6]表明血清VEGF水平升高是1型糖尿病微血管并發(fā)癥的獨立影響因素，并且VEGF水平與糖血紅蛋白呈正相關(guān)。在本研究中觀察組孕婦VEGF水平顯著高于對照組。這是因為母體的VEGF主要來源于胎盤和滋養(yǎng)細胞，當孕婦處于高血糖狀態(tài)時，促進了有絲分裂激酶的介導作用；當GDM孕婦血糖水平升高時，胎盤微血管慢性缺氧，刺激了VEGF的表達。因此，在臨床上可以通過檢測VEGF的表達來判定糖尿病的病程及血糖的控制情況。

VEGF基因多態(tài)性的位點主要位于5，非翻譯區(qū)和3，非翻譯區(qū)。既往的研究發(fā)現(xiàn)VEGF基因多態(tài)性與肥胖及多囊卵巢綜合征易感性有關(guān)，并且肥胖及多囊卵巢綜合征與2型糖尿病的易感基因相類似[7]。鄧仁生等[8]研究認為VEGF基因多態(tài)性增加2型糖尿病患者的發(fā)病風險。在本研究中VEGF-460C/T基因存在CC、CT、TT三種基因型，基因型和等位基因符合符合Hardy-Weinberg平衡，提示選擇的全體具有代表性。在本研究中CC型孕婦GDM發(fā)病率顯著高于CT、TT型孕婦，提示C等位基因可能是GDM的易感基因。另外本研究顯示VEGF基因多態(tài)性及血清VEGF水平是孕婦發(fā)生GDM的獨立危險因素。

綜上所述：血清VEGF水平及VEGF基因多態(tài)性是孕婦發(fā)生GDM的獨立危險因素，且C等位基因可能是GDM的易感基因。