UHPLC-Oribtrap/HRMS技術(shù)分析干姜中非揮發(fā)性化學(xué)成分在炮制前后的變化

陳琛，耿劍亮，匡海學(xué)，王秋紅

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

干姜為姜科(Zingiberaceae)植物姜ZingiberoficinaleRosc.的干燥根莖，是中醫(yī)臨床常用溫里藥，具有溫中散寒、回陽(yáng)通脈、溫肺化飲的功效。干姜經(jīng)過(guò)砂燙炮制后成為炮姜，具有溫中散寒、溫經(jīng)止血的功效。其辛燥之性較干姜弱，溫里之力不如干姜迅猛，但作用緩和持久，長(zhǎng)于溫中止痛、止瀉和溫經(jīng)止血[1-2]。現(xiàn)代研究表明干姜具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌止瀉、抗缺氧、抗腫瘤、心肌保護(hù)等藥理作用[3-7]。炮姜?jiǎng)t具有止血止痛、抗炎、抗?jié)兊茸饔肹8]。

干姜中非揮發(fā)性化學(xué)成分含量較高，在煎煮過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)于研究干姜的有效成分、藥材質(zhì)量控制以及炮制原理具有重要意義，主要包括姜辣素類、二芳基庚烷類、黃酮類及植物多糖等。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)姜科植物化學(xué)成分開(kāi)展了多方面研究[9-13]。化學(xué)成分的改變是中藥炮制前后功效變化的基礎(chǔ)。炮姜的性味歸經(jīng)及功效與干姜均有明顯不同，說(shuō)明其成分也發(fā)生了質(zhì)和量的變化，目前對(duì)于干姜炮制過(guò)程化學(xué)成分變化的研究相對(duì)較少。本研究基于超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-Oribtrap/HRMS)技術(shù)，在鑒定干姜非揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)炮制前后變化的特征化學(xué)成分，并對(duì)其進(jìn)行抗炎相關(guān)的藥理活性評(píng)價(jià)，以期為揭示干姜及炮姜藥效作用機(jī)制，完善炮制工藝及提高飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

干姜購(gòu)買于廣州金屬倉(cāng)藥材集散中心，由廣東藥科大學(xué)李書(shū)淵教授鑒定為姜科(Zingiberaceae)植物姜ZingiberoficinaleRosc.的干燥根莖)；炮姜根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》四部通則0213炮制而成；乙腈、甲醇(質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；甲酸(質(zhì)譜純，德國(guó)默克公司)。

1.2 儀器與材料

Thermo Orbitrap Fusion靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；湘儀H1750R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)；電子分析天平(德國(guó)Mettler Toledo公司)；CVE-3000型離心濃縮裝置(上海愛(ài)朗儀器公司)；Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。RAW264.7細(xì)胞，來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(上海雙洳生物科技有限公司)，脂多糖(南京大治生物科技有限公司)，二甲基亞砜(上海阿拉丁試劑有限公司)，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(廣州潔特生物有限公司)，0.25%胰酶細(xì)胞消化液(美國(guó)Gibco公司)。

1.3 樣品前處理方法

樣本配制方法：干姜和炮姜研碎后過(guò)0.45 mm篩網(wǎng)，得干姜與炮姜粉末。稱取干姜、炮姜粉末各200 mg置于10 mL試管中，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇水溶液，超聲30 min。取適量1 mL上清液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液揮干，殘?jiān)?00 μL體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇復(fù)溶，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液60 μL，轉(zhuǎn)移到含有內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶中待測(cè)。所有測(cè)試樣本各取20 μL，混勻后作為質(zhì)控樣本(QC)。

1.4 液相色譜分析條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A、以0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～2 min，10%～20%A；2～15 min，20%～85%A；15～15.1 min，85%～100%A；15.1～19 min，100%A；19～19.1 min，100%～10%A；19.1～21 min，10%A。流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

1.5 質(zhì)譜分析條件

熱噴霧離子源(HESI)，正離子掃描模式，噴霧電壓：3.20 kV，離子傳輸管溫度：300 ℃，蒸發(fā)溫度：320 ℃，鞘氣：30 L/min，輔助氣：10 L/min。負(fù)離子掃描模式，噴霧電壓：2.80 kV，離子傳輸管溫度：300 ℃，蒸發(fā)溫度：320 ℃，鞘氣：20 L/min，輔助氣：6 L/min。掃描方式：Full MS/ddMS2，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：120～1 200m/z，分辨率：120 000，碎裂能量：15、25和35，動(dòng)態(tài)扣除時(shí)間：6 s。

1.6 數(shù)據(jù)處理

Orbitrap Fusion Tune軟件、Xcalibur 4.1軟件(美國(guó)Thermo Fisher公司)用于質(zhì)譜控制和數(shù)據(jù)采集，Compound Discoverer 3.0軟件(美國(guó)Thermo Fisher公司)用于色譜峰提取，MS Frontier 8.0軟件(美國(guó)Thermo Fisher公司)用于化合物二級(jí)碎片結(jié)構(gòu)的推測(cè)與鑒定，Simca-P 14(瑞典Umetrics公司)軟件用于多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 活性測(cè)試

將細(xì)胞以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化，離心收集，用含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×106mL-1，均勻接種至96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h取出96孔板，吸去原來(lái)的培養(yǎng)基，加入以無(wú)血清DMEM配制的含藥培養(yǎng)基(溶劑對(duì)照組：每孔加入200 μL含0.1%DMSO的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；模型組：每孔加入198 μL含0.1%DMSO的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基；給藥樣品組：每孔加198 μL含不同濃度藥物的培養(yǎng)基)，同時(shí)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加藥后將96孔板放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后取出，除空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組外，其余每孔加入2 μL的100 μg/mL的LPS(終濃度為1 μg/mL)后放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 h。

NO的Griess檢測(cè)步驟：培養(yǎng)22 h后，取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液上清液加到新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入50 μL Griess A試劑(1%對(duì)氨基苯磺酰胺的5%H3PO4水溶液)，混勻，反應(yīng)2 min。加入50 μL Griess B試劑(0.1%N-1-萘基乙二胺)避光反應(yīng)10 min。在540 nm處測(cè)每孔的光吸收值(OD540)。IC50的計(jì)算軟件為Graphad Prism 7.0，計(jì)算方法采用線性回歸分析。

抑制率計(jì)算公式：抑制率=(模型組NO平均含量-樣品組NO平均含量)/(模型組NO平均含量-DMSO組NO平均含量)×100%。

2 結(jié)果

2.1 基于UHPLC-Oribtrap/HRMS的干姜特征化學(xué)成分鑒定

在優(yōu)化提取方式及質(zhì)譜測(cè)試參數(shù)后，采集得到干姜在正/負(fù)離子掃描模式下的總離子流色譜圖如圖1所示，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、碎裂方式解析及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)等方法共鑒定出74個(gè)化合物，其中姜辣素類45個(gè)，二苯基庚烷類28個(gè)，黃酮類1個(gè)，如表1所示。選擇具有代表性結(jié)構(gòu)特征的成分對(duì)其二級(jí)質(zhì)譜碎裂方式進(jìn)行分析，如圖2所示。在正離子HCD碎裂模式下，利用高分辨(MS，R=120 000；MS2，R=30 000)的DDA數(shù)據(jù)采集模式對(duì)姜辣素類成分碎裂規(guī)律進(jìn)行分析，姜酚類及姜烯酚類化合物通過(guò)C3-C4斷裂生成m/z=179.09(C10H11O3)的特征碎片；C5-C6斷裂并脫水生成m/z=177.09(C10H13O2)的特征碎片；C1-C2斷裂生成m/z=137.06(C8H9O2)或m/z=151.07(C9H11O2)的特征碎片。二苯基庚烷類化合物通過(guò)相同的斷裂方式生成相應(yīng)特征碎片離子。結(jié)合精確分子質(zhì)量推測(cè)分子式和不飽和度(姜酚及姜烯酚類Ω=5或6;二苯基庚烷類Ω≥9)能夠?qū)@類特征性成分進(jìn)行鑒定。

表1 干姜中鑒定的特征化合物信息

(續(xù)表一)

(續(xù)表二)

(續(xù)表三)

(續(xù)表四)

2.2 干姜炮制前后差異成分的篩選與鑒定

最終提取出398個(gè)色譜峰。通過(guò)Simca-P軟件將數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析(PCA)，得到干姜、炮姜和QC樣本的PCA得分圖(圖3)，QC樣本聚集度高說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中儀器穩(wěn)定性良好、數(shù)據(jù)可靠。干姜組和炮姜組分別位于第三和第四象限內(nèi)，表明2組樣本之間在化學(xué)成分種類和含量方面存在明顯差異。

表2 干姜炮制前后化合物變化的特征性成分

2.3 干姜炮制前后差異成分的活性評(píng)價(jià)

結(jié)果顯示(表3)，姜烯酚類化合物(1～4)對(duì)NO的分泌的抑制作用強(qiáng)于姜酚類(5～6)及姜酮類化合物(7～8)，且化合物1～2的IC50值小于10 μmol/L，說(shuō)明這2個(gè)化合物均有良好的體外抗炎活性。

表3 化合物體外抗炎(NO)的IC50的測(cè)定(μmol·L-1)

3 討論

本研究利用UHPLC-Orbitrap/HRMS技術(shù)，對(duì)干姜炮制前后非揮發(fā)性差異化學(xué)成分進(jìn)行分析。從干姜中鑒定了72個(gè)化合物，包括姜辣素類45個(gè)，二苯基庚烷類26個(gè)，黃酮類1個(gè)。干姜中揮發(fā)性成分沸點(diǎn)較低，在炮制過(guò)程中會(huì)受熱流失，使炮姜辛散之性減弱。本研究采用代謝組學(xué)多變量分析方法描繪干姜炮制前后非揮發(fā)性成分的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示11個(gè)化合物在炮制后相對(duì)含量有顯著差異，炮制后干姜中姜烯酚類化合物相對(duì)含量升高趨勢(shì)明顯。姜烯酚類物質(zhì)是干姜中主要辣味成分之一。鮮姜中姜烯酚類成分含量相對(duì)較低，我們推測(cè)在炮制加熱的過(guò)程中，由于姜酚類化合物C3位羰基和C5位羥基化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，能夠發(fā)生脫水反應(yīng)進(jìn)而生成姜稀酚類物質(zhì)。此外有報(bào)道干姜貯存過(guò)程中姜烯酚類成分含量也會(huì)有所提高，這是由于干姜為根部入藥，植物根系中普遍存在共生菌類，所以除了受熱分解外在貯存過(guò)程中微生物也可能參與干姜化學(xué)成分的代謝轉(zhuǎn)化。這說(shuō)明姜烯酚類成分的含量對(duì)于干姜和炮姜的藥效具有重要作用。藥理研究表明干姜中姜辣素類成分能夠有效緩解結(jié)腸炎、胃潰瘍等消化系統(tǒng)疾病的病理癥狀[14-15]。炮姜臨床上主要用于腹痛、腹瀉和多種出血疾病的治療。炎癥是引起組織毛細(xì)血管破裂出血的重要病理因素。根據(jù)干姜炮制前后差異化合物分析結(jié)果，本研究利用LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞模型，以抑制炎性細(xì)胞因子NO的分泌為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)干姜炮制前后8個(gè)含量較高的姜烯酚類和姜酮類差異成分的抗炎活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示姜烯酚類化合物具有良好的抗炎活性。這提示干姜炮制后姜烯酚類成分含量提高是炮姜發(fā)揮抗炎止血藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。