基于炮姜有效成分篩選炮姜炮制輔料河砂粒徑及其炮制工藝研究

黎代余，馮 圖，汪青筑，查 欽，劉洪明，徐蓮，刁家文

(1.畢節(jié)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 生態(tài)工程學(xué)院，貴州 畢節(jié) 551700；3.畢節(jié)市中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700)

炮姜是姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根莖經(jīng)砂燙而成的炮制品，具有溫中散寒、溫經(jīng)止血的功效，臨床用于治療中氣虛寒引起的腹痛、腹瀉及虛寒性出血癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，炮姜中的主要成分為姜酚(gingerol)，其中含量較高的為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等。2015版《中國藥典》一部以6-姜酚為炮姜的質(zhì)量控制指標(biāo)，并規(guī)定其含量不低于0.30%。有關(guān)炮姜研究的文獻較多，主要集中在炮姜經(jīng)炮制后化學(xué)成分的變化及炮制工藝上[2-3]，但在提到炮姜炮制輔料河砂時，均參照《中國藥典》所述之河砂或細(xì)砂，河砂粒徑大小并沒有明確的說明，關(guān)于使用何種粒徑河沙的研究也未見報道。本文以不同粒徑河砂為研究對象，分析比較在相同的炮制時間、炮制溫度、料藥比下炮制的炮姜中6-姜酚、8-姜酚、10姜酚以及總姜酚的含量差異，優(yōu)選出適合炮姜炮制的河砂，并對其炮制工藝進行研究，以期為規(guī)范炮姜炮制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate 3000XRS型高效液相色譜儀，配有UltiMate 3000四元梯度泵、DAD二極管陣列檢測器、Chromeleon工作站、U3000 TCC-3000SD標(biāo)準(zhǔn)柱溫箱(美國賽默飛公司)；ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司)；OHAUS CORPORATION電子分析天平(十萬分之一，美國OHAUS公司)；超聲機(上海冠特超聲儀器有限公司)；家用煤氣爐(福州萬寶電器有限公司)；泰克曼高溫測溫儀TD1100(泰克曼(南京)電子有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)粒度篩(浙江上虞市道墟張興砂篩廠)；鐵鍋(生鐵鑄，購于一般菜市場)。

1.2 試藥

干姜藥材購于荷花池藥材市場，經(jīng)試驗組成員貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院馮圖教授鑒定為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc．)的干燥根莖。對照品6-姜酚(批號：MUST 1712 0205)、對照品8-姜酚(批號：MUST 1832 804)、對照品10-姜酚(批號：MUST 1833 004)，均購自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)，甲醇(分析純，天津市富宇精化工有限公司)，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜酚含量測定

2.1.1 河砂制備 將取自河灘的河砂先用12 mm孔徑的篩子篩去粗大砂粒，然后用不同規(guī)格的篩子篩選出1 mm、3 mm、5 mm、7 mm和9 mm粒徑的砂子，用自來水沖洗至見清水，將砂子瀝干后置于鐵鍋內(nèi)加熱翻炒除去水分，備用。混合砂為1 mm、3 mm、5 mm、7 mm和9 mm粒徑的河砂等質(zhì)量混合而成。

2.1.2 炮姜炮制品及干姜藥材制備[4]按照《中國藥典》2015版第四部(通則0213)項下燙法要求，稱取“2.1.1”項下各規(guī)格河砂3 kg置于鐵鍋內(nèi)，武火加熱，炒至靈活狀態(tài)，測定離鍋底1 cm處的溫度，使其保持在(185±3)℃，再加入大小、厚度相近的干姜片0.3 kg，不斷翻動，炮制時間7 min，快速出鍋，篩去河砂、放涼，粉碎后過60目篩備用。另取干姜藥材適量，粉碎過60目篩備用。

2.1.3 對照品儲備液制備 精密稱取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對照品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為76.5 μg/mL、73.5 μg/mL和55.51 μg/mL的對照品儲備液。

2.1.4 混合對照品溶液制備 分別吸取6-姜酚、8-姜酚、10姜酚對照品儲備液各5 mL，置于25 mL容量瓶中，搖勻，制得濃度分別為25.5 μg/mL、24.5 μg/mL和18.5 μg/mL的對照品混合溶液。

2.1.5 供試品溶液制備 分別取干姜、各炮姜粉末約0.5 g，精密稱定，分別置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超聲(100 W，40 Hz)45 min，放冷，稱量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.6 色譜條件[5]流動相：乙腈(A)-水(B)，流速：0.6 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL，檢測波長：280 nm。梯度洗脫程序為：0→15 min，15%～50%A；15→45 min，50%A；45→60 min，50%～80%A；60→65 min，80%～85%A；65→90 min，85%～90%A；90→100 min，90%A；100→110 min，90%～15%A。

2.1.7 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，分別進樣，測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，各對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸。結(jié)果見表1。

方達生和陳清都沒有責(zé)備我，只是小心翼翼地安撫我，唯恐絆動了我脆弱的神經(jīng)。他們還感謝我能將孩子還給他們，并承諾再往我的賬戶里打十萬塊錢以示感謝。錢？我自嘲地笑了。

表1 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.8 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，按照“2.1.6”項下色譜條件進樣測定，測得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為1.69%、2.52%、1.95%，結(jié)果表明儀器精密良好。

2.1.9 穩(wěn)定性實驗 取5 mm河砂炮制的炮姜藥材0.5 g，按照“2.1.5”項下操作制備溶液，分別于放置0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時按照“2.1.6”項下方法測定峰面積，結(jié)果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為3.11%、2.78%、3.43%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性實驗 取3 mm河砂炮制的炮姜藥材0.5 g 6份，按照“2.1.5”項下方法制備溶液，再按照“2.1.6”項下方法測定峰面積，結(jié)果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面積RSD分別為2.71%、3.33%、3.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率實驗 取3 mm河砂炮制的炮姜藥材，按照“2.1.5”項下方法制備溶液6份，每份0.25 g，分別加入一定量的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對照品溶液，按照“2.1.5”項下方法制備溶液6份，再按照“2.1.6”項下方法測定峰面積，結(jié)果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的平均回收率分別為101.58%、97.99%、98.21%，RSD分別為2.61%、2.74%、1.90%，結(jié)果表明該方法回收率良好。

河砂粒徑(mm)6-姜酚含量8-姜酚含量10-姜酚含量總姜酚含量10.314±0.0280.073±0.0130.163±0.0130.550±0.05230.406±0.0140.102±0.0080.227±0.0200.728±0.03250.344±0.0220.089±0.0060.187±0.0100.620±0.02970.367±0.0620.093±0.0140.186±0.0490.646±0.08090.356±0.0180.093±0.0240.189±0.0250.637±0.096混合河砂0.351±0.0260.091±0.0030.167±0.0180.610±0.008干姜0.473±0.0220.095±0.0070.209±0.0040.777±0.024

注：總姜酚含量=(6-姜酚)+(8-姜酚)+(10-姜酚)。

由表2可以看出，3 mm粒徑河砂炮制的炮姜中6-姜酚和總姜酚含量最高，分別為0.406%和0.728%；8-姜酚含量在炮姜和干姜樣品中沒有明顯變化；10-姜酚在3 mm粒徑河砂炮制的炮姜和干姜樣品中的含量相較其他粒徑河砂炮制品略有升高。參照《中國藥典》2015版一部炮姜項下的規(guī)定，3 mm粒徑的河砂是炮制炮姜最為合適的輔料。

2.2 炮姜炮制工藝研究

以3 mm河砂為輔料，稱取規(guī)格大小均勻的干姜藥材36份，每份300 g。炮制方法：取10倍量3 mm河砂置于鐵鍋內(nèi)，武火加熱炒至靈活狀態(tài)，測定離鍋底1.0 cm處溫度，使其達到設(shè)定為炒制溫度時，再加入干姜藥材，按照“2.1.2”項下操作炮制。炮姜炮制工藝及結(jié)果見表3。

a：6-姜酚；b：8-姜酚；c：10-姜酚

樣品溫度(℃)時間(min)6-姜酚含量(%)8-姜酚含量(%)10-姜酚含量(%)總姜酚含量(%)S1S2S3S4185±350.411±0.0620.098±0.0170.223±0.0210.741±0.08160.390±0.0830.098±0.0160.221±0.0610.708±0.01770.400±0.0300.096±0.0240.217±0.0370.712±0.08080.367±0.0350.093±0.0060.211±0.0310.671±0.070S5S6S7S8195±350.414±0.0600.106±0.0300.240±0.0580.757±0.01360.401±0.0440.096±0.0210.224±0.0630.715±0.01170.394±0.0610.100±0.0080.221±0.0100.715±0.07480.392±0.0100.100±0.0040.216±0.0190.708±0.015S950.406±0.0200.096±0.0550.213±0.0070.715±0.049S10S11S12205±360.389±0.0370.096±0.0010.203±0.0340.688±0.06270.392±0.0190.099±0.0800.222±0.0350.713±0.01580.397±0.0160.090±0.0420.211±0.0710.698±0.044

從表3結(jié)果可以看出，以3 mm河砂為炮制輔料，以195 ℃為炮制溫度，炮制時間為5 min時，炮姜中6-姜酚、總姜酚含量最高，8-姜酚和10-姜酚含量與其他炮制溫度和炮制時間比較變化不大。因此，以3 mm河砂為炮制輔料，炮制時間5 min，炮制溫度195 ℃為炮姜炮制的最佳工藝。

2.3 工藝驗證試驗

以3 mm河砂為炮制輔料，炮制時間5 min，炮制溫度195 ℃炮制炮姜10份，每份300 g，按照“2.2”項下方法炮制炮姜，以炮姜HPLC指紋圖譜相似度及SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析工藝的穩(wěn)定性。

2.3.1 HPLC指紋特征圖譜測定 取10批炮姜樣品，按照“2.1.5”項下方法制備樣品溶液，于“2.1.6”項下色譜條件下對10批炮姜藥材進行測定，記錄圖譜，圖譜以(.cdf)格式導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A)”生成對照圖譜，并進行相似度計算，同時測定6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚及總姜酚的含量。結(jié)果見表4、圖2、圖3。

表4 10批炮姜藥材的指紋圖譜相似度及其姜酚含量 (%)

圖2 指紋對照圖譜

圖3 10批炮姜指紋圖譜

從10批炮姜指紋圖譜來看，在本工藝條件下炮制的炮姜的化學(xué)成分沒有明顯變化，每批炮姜HPLC圖譜上相應(yīng)的保留時間上出峰具有一致性。從相似度來看，炮制的10批炮姜相似度均在0.997以上，說明炮制的炮姜相似度較高。

2.3.2 SPSS22.0對炮姜中姜酚測定結(jié)果分析 將10批炮姜中變化較大的兩種指標(biāo)成分，即6-姜酚和總姜酚的測定值輸入SPSS22.0進行描述統(tǒng)計，獲得6-姜酚和總姜酚的正態(tài)分布Q-Q圖(見圖4)。結(jié)果10批炮姜中6-姜酚和總姜酚觀測值(測定值)在一條直線附近，符合正態(tài)分布，表明在此工藝下炮制的炮姜藥材具有很好的穩(wěn)定性。

圖4 6-姜酚和總姜酚的正態(tài)分布Q-Q圖

3 討論

中藥的功效是有效組分綜合作用的結(jié)果，因此研究炮姜炮制工藝時，本實驗以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚及總姜酚含量為指標(biāo)進行綜合考察，能全面控制炮姜的質(zhì)量。試驗結(jié)果表明，以3 mm粒徑河砂炮制炮姜最為合適，最終炮制工藝為3 mm河砂，炮制時間5 min，炮制溫度195 ℃。驗證實驗表明本工藝具有極高的穩(wěn)定性，這一結(jié)果對規(guī)范炮姜的炮制具有指導(dǎo)意義。

在研究炮制工藝過程中，試驗組以4 min為考察時間考察了炮姜的炮制，但并未達到炮姜炮制時表面棕褐色、內(nèi)部黃色的要求。同時發(fā)現(xiàn)，河砂粒徑越大，炮姜發(fā)脹鼓起越難，要達到炮制感官要求需要更長的時間，且有效成分含量會相應(yīng)降低，實驗組認(rèn)為這是河砂與干姜接觸面積減小導(dǎo)致受熱不均、傳熱不足所致。

有文獻報道稱，炮姜在炮制過程中，會有新的姜酮產(chǎn)生，但本試驗在HPLC分析過程中在姜酮的保留時間內(nèi)未在炮制品中見到姜酮這一成分，而在5～7.5 min范圍，炮姜出現(xiàn)了兩個較明顯的峰，可能是由于炮姜在炮制時產(chǎn)生極性較大的物質(zhì)所致。本實驗還發(fā)現(xiàn)，無論是干姜還是炮姜，其HPLC圖譜上保留時間為97 min時均有一化學(xué)成分具有很高的含量，韓燕全等[4]在研究炮姜工藝時圖譜上也具有這一特征，但對未其成分進行說明，該成分有待進一步研究。