HPLC法測(cè)定條葉旋覆花不同部位中線葉旋覆花內(nèi)酯A的含量

李玉斌，葉 霽，張衛(wèi)東 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室，上海 200433）

金沸草（Inulae Herba）為菊科（Asteraceae）植物條葉旋覆花（Inula linariifoliaTurcz.）或旋覆花（Inula japonicaThunb.）的干燥地上部分，被列入2015年版《中國(guó)藥典》，具有降氣、消痰、行水的功效，臨床上應(yīng)用廣泛[1]。金沸草的不同基源中，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道過旋覆花的含量測(cè)定，而條葉旋覆花的含量測(cè)定目前尚未見報(bào)道[2-6]。

前期研究發(fā)現(xiàn)線葉旋覆花內(nèi)酯A（britanin）是從條葉旋覆花中分離得到的含量較高且抗炎活性顯著的一個(gè)倍半萜內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，線葉旋覆花內(nèi)酯A可應(yīng)用于慢性阻塞性肺疾病[7]及心肌炎[8]的預(yù)防和治療，具有神經(jīng)保護(hù)[9]功能，能夠通過抑制NF-κB和MAPK信號(hào)通路降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的一氧化氮（NO）、前列腺素和炎性細(xì)胞因子的分泌水平[10]。這些功能與金沸草治療“外感風(fēng)寒，痰飲蓄結(jié)，胸膈脾滿”相對(duì)應(yīng)，因此可將其作為條葉旋覆花的重要質(zhì)量標(biāo)志物[1]。本研究?jī)?yōu)化了線葉旋覆花內(nèi)酯A的提取方法和色譜條件，并開展系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)，建立了HPLCUV法測(cè)定條葉旋覆花的干燥地上部位和頭狀花序中線葉旋覆花內(nèi)酯A的含量測(cè)定方法，確定了含量較高的部位，有助于藥材的合理應(yīng)用。該方法操作簡(jiǎn)單，方便快捷，可為金沸草的基源藥材條葉旋覆花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供數(shù)據(jù)支持和科學(xué)依據(jù)。

圖 1 線葉旋覆花內(nèi)酯 A 的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 儀器

HP-1100系列高效液相色譜儀（惠普，美國(guó)）；G1311A 四元泵、G1313A 自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1314A VWD可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、G1315B DAD二極管陣列檢測(cè)器（安捷倫，美國(guó)）；Agilent Zorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；安捷倫，美國(guó)）；BP211D 型電子天平（Sartotius，德國(guó)）。

1.2 藥材與試劑

7批條葉旋覆花的干燥地上部分購(gòu)自不同地區(qū)，獲得的頭狀花序部位經(jīng)由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室張漢明教授鑒定；線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品（britanin）為實(shí)驗(yàn)室自制，化學(xué)分子式為C19H26O7，相對(duì)分子質(zhì)量為366。經(jīng)紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）分析，純度≥98%，符合中藥化學(xué)對(duì)照品的含量測(cè)定要求；乙腈為 J.T Baker 色譜純，水為 Milli-Q 超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取條件

超聲法提取，超聲時(shí)間為40 min。溶劑：100%甲醇。溶劑體積倍數(shù)：40倍。

2.2 色譜條件

色譜柱為 Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；安捷倫，美國(guó)）；初始流動(dòng)相為乙腈-水（30:70），在 20 min 內(nèi)升至乙腈-水（40:60）進(jìn)行梯度洗脫，流速始終為 1.2 ml/min；柱溫為恒溫 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 212 nm。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取1.21 mg線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品，置于10 ml容量瓶中，用100%甲醇溶解后定容，搖勻，獲得 1 ml中含有線葉旋覆花內(nèi)酯 A 0.121 mg的對(duì)照品溶液（濃度為0.121 mg/ml），冷藏備用。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱定條葉旋覆花（頭狀花序）粉末(過3號(hào)篩) 和條葉旋覆花（干燥地上部分）粉末(過3號(hào)篩)各1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入40 ml 100%甲醇，密塞，稱重，超聲提取60 min后，靜置放冷，再稱重，加100%甲醇溶液補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，在 5 000 r/min 條件下離心 10 min，取上清液，即得條葉旋覆花頭狀花序和干燥地上部分的供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液（0.121 mg/ml）和“2.4”項(xiàng)下制備的兩種供試品溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄并查看保留時(shí)間為12.2 min處峰上5點(diǎn)的紫外吸收?qǐng)D。如圖2所示，兩種供試品溶液的最大吸收波長(zhǎng)與對(duì)照品溶液的最大吸收波長(zhǎng)一致，峰形均為單一峰，分離度達(dá)到規(guī)定的要求，該方法的專屬性良好。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取“2.3”項(xiàng)下制備的濃度為0.121 mg/ml的線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品溶液各0.5、1、2、4、10、16、20、24 μl，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行色譜測(cè)定，記錄峰面積積分值。以線葉旋覆花內(nèi)酯A的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（Χ，相當(dāng)于μg數(shù)），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得線葉旋覆花內(nèi)酯A含量測(cè)定的回歸方程為Y= 1 040.5Χ+1.379（r= 1.000 0），理論板數(shù)平均為 25 554。結(jié)果顯示線葉旋覆花內(nèi)酯A在0.060～2.904 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取等量 “2.3”項(xiàng)下制備的線葉旋覆花內(nèi)酯 A 對(duì)照品溶液（0.121 mg/ml），根據(jù)“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行色譜測(cè)定，記錄線葉旋覆花內(nèi)酯A的峰面積，連續(xù)測(cè)定6次。計(jì)算結(jié)果顯示6份線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品溶液的峰面積RSD值為0.59%。表明儀器和方法具有較高的精密度，符合要求。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取 “2.4”項(xiàng)下制備的同一供試品，分別于提取后 0、1、2、4、6、8、10、12 h按“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行色譜測(cè)定，記錄各譜圖中線葉旋覆花內(nèi)酯A的峰面積。結(jié)果顯示，12 h內(nèi)線葉旋覆花內(nèi)酯A的峰面積的RSD為0.97%，具備良好的穩(wěn)定性。

2.5.5 重現(xiàn)性試驗(yàn)

圖 2 對(duì)照品溶液和兩種供試品溶液（批號(hào) 000 3）的 HPLC 圖

取樣品批號(hào)為000 3的條葉旋覆花5份，分別精密稱重，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定并計(jì)算線葉旋覆花內(nèi)酯A的峰面積。根據(jù)結(jié)果計(jì)算得到其平均峰面積積分值為399.9，平均峰面積積分值的RSD值為1.04%，表明該方法測(cè)定線葉旋覆花內(nèi)酯A的含量重現(xiàn)性良好。

2.5.6 檢測(cè)限和定量限

在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件下，以100%的甲醇為溶劑對(duì)線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品溶液（0.121 mg/ml）進(jìn)行倍比稀釋，按信噪比為3測(cè)定最低檢測(cè)限。結(jié)果表明，當(dāng)線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品的濃度為1.51 μg/ml、進(jìn)樣量為 1 μl時(shí)，峰信號(hào)約為噪聲的2 ～ 3 倍，即最低檢測(cè)限為 1.51 ng。將線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品溶液稀釋至濃度為0.453 μg/ml且信噪比約為10時(shí)，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得峰面積的RSD為1.96%，表明線葉旋覆花內(nèi)酯A對(duì)照品的定量限為 0.453 μg/ml，即 4.53 ng。

2.5.7 回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品6份（批號(hào)為000 3），分別精密加入與樣品中線葉旋覆花內(nèi)酯A含量相等的對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算線葉旋覆花內(nèi)酯A的含量、回收率和RSD值。結(jié)果如表1所示，線葉旋覆花內(nèi)酯A的平均回收率為95.77%，RSD為1.80%，表明該方法測(cè)定線葉旋覆花內(nèi)酯A的加樣回收率良好。

2.6 樣品的含量測(cè)定

分別精密稱取對(duì)照品與7個(gè)批次樣品的頭狀花序和干燥地上部分，按“2.3”項(xiàng)下與“2.4”項(xiàng)下分別制備對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的條件進(jìn)行色譜測(cè)定分析，每批樣品平行3次，記錄峰面積。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算7批樣品中線葉旋覆花內(nèi)酯A的平均含量。結(jié)果如表2所示，條葉旋覆花的頭狀花序中線葉旋覆花內(nèi)酯A的平均含量為0.732%，干燥地上部分中線葉旋覆花內(nèi)酯A的平均含量為0.125%，僅為頭狀花序的1/7。

表 1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表 2 條葉旋覆花的頭狀花序及地上干燥部分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

提取方法和色譜條件是經(jīng)過優(yōu)化后選用的。本研究考察了超聲、回流、浸漬3種提取方法，其中冷浸法提取出的線葉旋覆花內(nèi)酯A含量最高，盡管提出率高，但提取的雜質(zhì)最多，影響測(cè)定，熱回流法提出的含量最低?？紤]提取方法的提出率及操作的可行性和便捷性，選用超聲法提取條葉旋覆花中的線葉旋覆花內(nèi)酯A。隨后本研究考察了選擇不同溶劑（水、不同濃度的乙醇或甲醇等）、不同溶劑倍數(shù)的溶劑體積（10、20、40、60倍）及不同超聲時(shí)間（10、20、40、60 min）等條件對(duì)線葉旋覆花內(nèi)酯A的提取效果。結(jié)果顯示，當(dāng)溶劑為100%甲醇、體積倍數(shù)為樣品質(zhì)量的40倍、超聲時(shí)間為40 min時(shí)，可以將條葉旋覆花中的線葉旋覆花內(nèi)酯A充分提出。

通過比較 Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；島津，日本）、Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；瑞典）和 Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；安捷倫，美國(guó)）3種色譜柱，發(fā)現(xiàn) Agilent Zorbax SB C18柱能更好地分離條葉旋覆花藥材的化學(xué)成分，而且線葉旋覆花內(nèi)酯A峰峰形較好，理論板數(shù)較高，故選用該色譜柱分析。另外，本研究考察了不同柱溫（20、25、30 ℃）、不同流動(dòng)相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-甲酸等系統(tǒng)）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）等條件對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明柱溫在30 ℃，以乙腈-水為流動(dòng)相在1.2 ml/min的流速下梯度洗脫時(shí)，線葉旋覆花內(nèi)酯A峰能較好地與其他峰達(dá)到基線分離。通過上述優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最終確定了方法部分所用的提取條件和色譜條件。

本文建立的以線葉旋覆花內(nèi)酯A為標(biāo)志物的金沸草的質(zhì)量控制方法，能夠幫助研究人員在對(duì)金沸草的研究開發(fā)過程中，對(duì)線葉旋覆花內(nèi)酯A的含量進(jìn)行質(zhì)量控制，區(qū)分偽劣及混淆藥材，選擇質(zhì)量合格的金沸草藥材。另外，本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于條葉旋覆花的干燥地上部分，線葉旋覆花內(nèi)酯A在條葉旋覆花的頭狀花序中含量更高，是更有效的用藥部位，為臨床醫(yī)師用藥提供了參考。