納米孔測(cè)序技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

張彥斌 郭莉 靳志敏 王月 張宏博

摘 要：納米孔測(cè)序技術(shù)因低成本、快捷與可測(cè)長(zhǎng)片斷DNA等優(yōu)勢(shì)備受重視，其發(fā)展較為迅速。納米孔測(cè)序技術(shù)是將電信號(hào)作為基礎(chǔ)的物理方法測(cè)序，大量研究人員使高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物研究中使用，但是在食品微生物檢測(cè)中使用納米孔測(cè)序技術(shù)中使用研究比較少。以此，本文就對(duì)此方面進(jìn)行研究。

關(guān)鍵詞：納米孔測(cè)序；微生物檢測(cè)；食品檢測(cè)

隨著人民生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對(duì)于食品質(zhì)量安全尤為重視。食品污染的主要來(lái)源為微生物污染，影響了食品質(zhì)量的安全性，對(duì)消費(fèi)者健康造成危害，要利用有效監(jiān)測(cè)方法實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)。利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)雖然效果良好，但是操作的過(guò)程較為復(fù)雜，培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法滿足快速監(jiān)測(cè)需求。目前，為了進(jìn)一步提高檢測(cè)效率，研究人員在食品微生物檢測(cè)中使用了分子生物學(xué)技術(shù)，尤其是食源性致病菌檢測(cè)。常用的分析生物技術(shù)包括DNA序列分析技術(shù)、基因芯片技術(shù)、核酸探針技術(shù)等。DNA序列分析技術(shù)是基于基因水平實(shí)現(xiàn)的食品微生物的分析與鑒定，排除了檢測(cè)中的干擾因素。在技術(shù)的不斷發(fā)展中，DNA測(cè)序技術(shù)也得到了發(fā)展，納米孔測(cè)序技術(shù)為新型第三代DNA測(cè)序技術(shù)[1]。以此，本文就對(duì)在食品微生物監(jiān)測(cè)中使用納米孔測(cè)序技術(shù)進(jìn)行分析。

1 納米孔序列技術(shù)的分析

從嵌入溶血素蛋白通道對(duì)血脂的作用研究開(kāi)始，研究人員在十年前就把開(kāi)發(fā)并且探索了各種類型納米孔。α-溶血素屬于能連接到細(xì)胞膜中繼而導(dǎo)致細(xì)胞溶解的蛋白質(zhì)，在模型中，一層生物膜將溶液劃分成兩個(gè)區(qū)域，α-溶血素蛋白嵌入到生物膜中，構(gòu)成納米孔。在DNA分子穿越納米孔的時(shí)候，會(huì)改變阻斷電流，此時(shí)利用靈敏電子元件檢測(cè)電流變化。但是，因?yàn)?種堿基的理化性質(zhì)較為接近，序列讀取比較困難。另外，降低電子噪聲是一個(gè)挑戰(zhàn)，利用降低DNA位移速率能夠降低部分噪聲。新出的新形式仿生納米孔包括仿生核孔復(fù)合物與絲蛋白毛孔，跨孔形成的側(cè)電極使利用納米孔轉(zhuǎn)運(yùn)的生物分子的電子檢測(cè)成為可能。使用等離子體減薄儀與離子束雕刻技術(shù)得出超薄納米孔，利用耦合到納米孔的掃描探針顯微鏡，證實(shí)利用此靜電效應(yīng)與場(chǎng)效應(yīng)能夠代替檢測(cè)方式可行性[2]。

DNA酶能夠結(jié)合DNA鏈，但其作用酶催化反應(yīng)速度的限制，速度達(dá)到每個(gè)核苷酸幾個(gè)ms級(jí)別。相關(guān)研究表示，利用DNA外切酶Ⅰ切下核苷酸，基于電壓驅(qū)動(dòng)，利用α-HL納米孔實(shí)現(xiàn)區(qū)分，甚至包括甲基化dCMP。雖然能夠區(qū)分核苷酸，但是還是要對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行優(yōu)化：①優(yōu)化DNA外切酶Ⅰ，使其能夠在高壓條件下工作；②對(duì)外切酶和納米孔距離進(jìn)行控制，正確檢測(cè)切下來(lái)的順序；對(duì)DNA外切酶Ⅰ切割速度，使酶切速度統(tǒng)一[3]。

2 納米孔序列的分類

根據(jù)不同的納米孔來(lái)源，DNA序列納米孔包括固態(tài)、生物兩種納米孔。生物納米孔工作原理詳見(jiàn)圖1，將高鹽溶液添加到檢測(cè)池中，在納米孔兩端設(shè)置電場(chǎng)，在單鏈DNA分子沒(méi)有通過(guò)納米孔時(shí)，會(huì)出現(xiàn)恒定電流。在單鏈DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)，電流會(huì)降低，導(dǎo)致阻斷電流信號(hào)的出現(xiàn)。通過(guò)放大電流信號(hào)，使其朝著數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)變。由于堿基的不同，所出現(xiàn)的阻斷電流信號(hào)也不同，通過(guò)不同的阻斷電流信號(hào)，對(duì)DNA堿基序列進(jìn)行識(shí)別。生物納米孔大部分為生物體內(nèi)天然存在的故有納米器件，具備生物活性、孔徑結(jié)構(gòu)與功能，由于能夠進(jìn)行自由的分子設(shè)計(jì)與生物修飾，備受科學(xué)家重視?，F(xiàn)代所常用的生物納米孔具備α-溶血素與恥垢分枝桿菌空蛋白A，詳見(jiàn)圖2[4]。

固態(tài)納米孔是由硅和其衍生物構(gòu)成，都是利用離子束或者電子束鉆出納米尺度孔洞，之后進(jìn)行孔大小與形狀的修飾。DNA分子與蛋白復(fù)合物利用納米孔導(dǎo)致阻塞電流差異，相關(guān)人員檢測(cè)了RNA與DNA聚合酶復(fù)合物、SSB蛋白-DNA復(fù)合物[5]。固態(tài)納米孔徑能夠控制，能夠應(yīng)用到DNA結(jié)合蛋白和DNA結(jié)合藥物的篩選中，還能夠?qū)εcDNA特異位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)判斷。寡聚核苷酸修飾之后的蛋白質(zhì)與多肽能夠基于電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，通過(guò)寡核苷酸引導(dǎo)過(guò)孔，并且解鏈蛋白促進(jìn)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析研究。

3 食品微生物檢測(cè)中的納米孔測(cè)序技術(shù)

分子生物學(xué)的發(fā)展改變了食品微生物的研究，代謝組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等并不依賴微生物培養(yǎng)技術(shù)，在食品微生物監(jiān)測(cè)中逐漸使用。高通量測(cè)序技術(shù)NGS也在食品微生物菌株測(cè)序檢測(cè)中使用，為研究人員探索食品安全提供了全新的研究方法。DNA測(cè)序技術(shù)不僅應(yīng)用到研究微生物多樣性與基因組學(xué)中，還能夠應(yīng)用到單個(gè)基因DNA序列的分析中，單一基因DNA序列可在食品微生物種類鑒定分析中使用。徐寶紅[6]等人利用PCR-焦磷酸測(cè)序制定基因測(cè)序，鑒定副溶血性弧菌。另外，還有研究人員也使用此方法對(duì)對(duì)16株腸炎沙門菌進(jìn)行了鑒定。徐寶紅等人利用PCR0焦磷酸測(cè)序方法，使用測(cè)得的DNA序列通過(guò)BLAST對(duì)目標(biāo)菌基因組序列進(jìn)行分析和對(duì)比，確定是否存在目標(biāo)菌。微生物基因組為BLAST分析基礎(chǔ)，只有越來(lái)越多的微生物基因測(cè)序被測(cè)定出來(lái)，此分析方法的適用范圍才會(huì)覆蓋大量的微生物種類。隨著微生物基因組學(xué)的持續(xù)發(fā)展，基因組測(cè)序食品微生物數(shù)量也在不斷的增加。

肉毒素為肉毒桿菌所產(chǎn)生的分子神經(jīng)毒素，具有較強(qiáng)的毒性，致死量為1ng/kg體重。因?yàn)槿舛舅啬軌蚶檬澄镦渹鞑?，?duì)人類的安全造成嚴(yán)重危害，所以也被應(yīng)用于生化武器。目前，肉毒素中的ABEF會(huì)對(duì)人類造成危害，毒害機(jī)理為抑制神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿，導(dǎo)致肌肉松弛麻痹，最終因呼吸肌麻痹死亡。納米孔技術(shù)為新型超靈敏快捷檢測(cè)手段，可在蛋白質(zhì)、多肽分析中使用。納米孔能夠利用酶切反應(yīng)的水解多肽分析研究蛋白酶功能，圖3為肉毒素B的分子結(jié)構(gòu)，在Zn2+條件下，肉毒素B能夠酶切神經(jīng)細(xì)胞突出蛋白，剪切位為76-77位氨基酸，生成C端sb2（77-93）與N端 Lp-sb2兩個(gè)片斷。所以，通過(guò)對(duì)兩個(gè)蛋白片段的納米孔過(guò)孔信號(hào)進(jìn)行分析，就能夠間接檢測(cè)肉毒素B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，以酶切后sb2（77-93）為生物標(biāo)記物，分析納米孔的過(guò)孔信號(hào)，在幾分鐘內(nèi)就能夠?qū)Φ陀?00pmol/L的有活性的肉毒素B進(jìn)行檢測(cè)，此方法在血清樣本體系分析中具有良好的效果。

隨著DNA測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，測(cè)序所需時(shí)間不斷縮短，花費(fèi)成本也在不斷降低。MinION為第一款正式量產(chǎn)的納米孔測(cè)序儀，體積比普通U盤要大。其默認(rèn)運(yùn)行時(shí)間為48 h，運(yùn)行2 min所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠在相應(yīng)分析中使用，每秒可識(shí)別250個(gè)堿基，平均讀長(zhǎng)為13～20kb。Menegon等人利用600個(gè)堿基DNA序列對(duì)熱帶雨林中野生蛙類具體種類進(jìn)行分析，序列錯(cuò)誤率為 5%～10%。提高了測(cè)試深度，能夠使MinION測(cè)序精準(zhǔn)率達(dá)到98%[7]。

4 結(jié)語(yǔ)

利用納米孔測(cè)序技術(shù)檢測(cè)食品微生物的成本比較低，并且能夠提高檢測(cè)速度。測(cè)序芯片使用壽命比較長(zhǎng)，使納米孔測(cè)序方便應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)中。相信在今后的研究中，通過(guò)學(xué)者的努力，能夠研發(fā)更加穩(wěn)定的生物納米孔，解決識(shí)別率低、速度過(guò)快等問(wèn)題，對(duì)納米孔測(cè)序技術(shù)進(jìn)行完善，使檢測(cè)的穩(wěn)定性得到提高。

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基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（編號(hào)：ZDZX2016016）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)資金項(xiàng)目（2017年度）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)資金項(xiàng)目（編號(hào)：KCBJ20 18068）。

作者簡(jiǎn)介：張彥斌（1983—），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，碩士，微生物檢驗(yàn)師。研究方向：食品質(zhì)量與安全。

通訊作者：張宏博（1986—），男，內(nèi)蒙古巴彥淖爾人，博士，工程師。研究方向：食品質(zhì)量與安全。