鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體存活、生長(zhǎng)及免疫的影響

沈曄 劉碧海 王興強(qiáng) 崔春輝 秦傳新

摘 要：虎斑烏賊（Sepia pharaonis）是熱帶和亞熱帶海區(qū)的頭足類(lèi)軟體動(dòng)物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。通過(guò)開(kāi)展鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體存活、生長(zhǎng)及免疫的影響試驗(yàn)，結(jié)果表明，虎斑烏賊幼體能夠適應(yīng)的鹽度范圍很大，但當(dāng)鹽度（鹽度17）過(guò)低時(shí)，幼體幾乎不能生存，活力不高、反應(yīng)遲鈍直至死亡;鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體的體重增長(zhǎng)具有顯著的影響（P<0.05），幼體在高鹽（鹽度26～32）時(shí)的生長(zhǎng)率較高，低鹽（鹽度20～23）環(huán)境下生長(zhǎng)比較緩慢;不同鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體的免疫調(diào)節(jié)也具有顯著的影響。當(dāng)鹽度為20～23時(shí)，幼體超氧化物歧化酶的活性最高，鹽度29時(shí)相對(duì)較低;推測(cè)虎斑烏賊幼體的最適鹽度為26～28。

關(guān)鍵詞：虎斑烏賊;鹽度;存活率;生長(zhǎng)率;免疫

中圖分類(lèi)號(hào) S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2020）07-0076-04

Abstract： Sepia pharaonis is a cephalopod of tropical and subtropical seas， which has important economic value. In this study， the effects of salinity on the survival， growth and immunity of squid larvae were studied. The results showed that the range of salinity that the larvae could adapt to was very large， but when the salinity was too low （salinity 17）， the larvae could hardly survive， with low activity， slow response and even death. Salinity had a significant effect on the growth of body weight（P<0.05）. The growth rate of larva was higher in high salt （salinity 26-32）， and slower in low salt （salinity 20-23）. Different salinity also had a significant effect on the immune regulation of larva. The activity of superoxide dismutase（SOD） was the highest when salinity was 20-23， and it was relatively low when salinity was 29. It is suggested that the optimum salinity of the larva is 26-28.

Key words： Sepia pharaonis; Salinity; Survival Rate; Growth Rate; Immune

虎斑烏賊（Sepia pharaonis）屬于頭足綱、烏賊科的軟體動(dòng)物，因胴背具許多虎斑而得名，分布于印度洋和太平洋等海域[1]。在我國(guó)，臺(tái)灣和南海沿海地區(qū)也是虎斑烏賊正常的棲身場(chǎng)所。虎斑烏賊具有生長(zhǎng)迅速、耐擁擠、耐運(yùn)輸、抗病性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高等特點(diǎn)，是具有極大養(yǎng)殖前景的經(jīng)濟(jì)頭足類(lèi)[2-4]。通常生活在水層底部，喜靜置，以節(jié)省能量消耗，前端能發(fā)出觸腕來(lái)獵取食物，且具有殘食現(xiàn)象，其幼體可能遭到攻擊，導(dǎo)致生長(zhǎng)受到抑制[5-6]。大部分烏賊都是廣鹽品種，而虎斑烏賊適應(yīng)的鹽度范圍更大一些，適應(yīng)溫度范圍較小，也無(wú)性早熟的特點(diǎn)。然而，受過(guò)度捕撈和環(huán)境污染等多重因素的影響，虎斑烏賊的自然資源量已逐漸減少。在國(guó)外如泰國(guó)等地，虎斑烏賊的人工養(yǎng)殖已有了一定的基礎(chǔ)，而我國(guó)烏賊養(yǎng)殖技術(shù)仍相對(duì)落后。當(dāng)前，對(duì)于烏賊的研究主要涉及生長(zhǎng)、行為、胚胎發(fā)育、攝食、營(yíng)養(yǎng)成分等領(lǐng)域[7-11]?；邽踬\受精卵的孵化率以及幼體存活率在不同的海水鹽度中變化較大?；邽踬\能夠適應(yīng)的鹽度范圍變化很大，但對(duì)烏賊幼體生存具有一定的影響，當(dāng)鹽度過(guò)分低時(shí)，幼烏幾乎不能夠生存[12];當(dāng)鹽度為15左右時(shí)，虎斑烏賊的受精卵幾乎不會(huì)存活;當(dāng)鹽度大于22、低于33時(shí)，鹽度對(duì)烏賊受精卵的影響趨勢(shì)變小，幾乎無(wú)變化[13]。本研究通過(guò)為期30d的不同鹽度試驗(yàn)，探討了鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體存活率、生長(zhǎng)率及免疫調(diào)節(jié)的影響，以期得到虎斑烏賊幼體的適宜生長(zhǎng)鹽度，為虎斑烏賊的幼體繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)生物 試驗(yàn)在連云港市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局大板橋養(yǎng)殖基地進(jìn)行。試驗(yàn)生物是來(lái)自廣東空運(yùn)過(guò)來(lái)的虎斑烏賊，取其受精卵，先在室內(nèi)育苗池內(nèi)孵化一段時(shí)間，孵化完畢之后，在其中選取體格健康，活力旺盛的烏賊幼體作為試驗(yàn)試體。

1.1.2 試驗(yàn)裝置 （1）在虎斑烏賊幼體孵化出來(lái)之后，用培養(yǎng)池來(lái)贍養(yǎng)烏賊幼苗。培養(yǎng)池采用的是6個(gè)直徑1.6m，高1m的圓形塑料池子。（2）試驗(yàn)用水是天然海水，經(jīng)紗濾后，加入淡水以調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)柠}度，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。需要注意的是鹽度的調(diào)節(jié)不能過(guò)快，緩慢調(diào)節(jié)用水鹽度的下降，每隔2d換2/3水。（3）室內(nèi)育苗池一般會(huì)配備相應(yīng)的蓄水池（水源來(lái)自后屋的海水中），蓄水池的規(guī)格一般為底面積12m2、深3m。這種蓄水池基地準(zhǔn)備了5個(gè)，用以換水沉淀，沉淀的海水通常用漂白粉消毒，每1m3海水加入20～30g的漂白粉，隨后讓水池靜置沉淀以及曝氣1～2d。靜置沉淀過(guò)的海水還需去除其中的氯，向其中加入適量的硫代硫酸鈉（Na2S2O3），劑量與漂白粉成1∶1的比例。（4）試驗(yàn)使用功率1.1kW，風(fēng)壓17.6kPa，風(fēng)量180m2/h的增氧機(jī)。每個(gè)池子的兩邊均勻分布著6個(gè)排氣孔連著6根氣石，但由于水體壓強(qiáng)以及氧氣供應(yīng)量的要求，關(guān)閉了部分排氣孔，以保證其他出氣孔有足夠的壓強(qiáng)輸出氧氣。

1.1.3 餌料來(lái)源 烏賊幼體剛孵化出世的3d內(nèi)，可以由其自身免疫來(lái)維持營(yíng)養(yǎng)需求。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，烏賊幼體攝食量日漸增加，必須從外界攝取食物。撓足類(lèi)、輪蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)均是烏賊幼體的主要餌料[14]。其中，撓足類(lèi)可以從基地外的塘口里捕獲，塘口與外界海水是相通的，海水中富含糠蝦以及撓足類(lèi)，這是本次烏賊幼體前期頗為重要的餌料來(lái)源。每天傍晚時(shí)分，用聚光燈照射水面，糠蝦、撓足類(lèi)因其趨光習(xí)性會(huì)聚集在聚光燈下，然后用80～100目的網(wǎng)撈取后投入培養(yǎng)池中，期間不需要投入其他餌料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在6個(gè)相同規(guī)格的培養(yǎng)池中進(jìn)行，分別設(shè)17、20、23、26、29和32等6個(gè)鹽度梯度，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，即在每個(gè)培養(yǎng)池中放置3個(gè)相同規(guī)格的塑料筐（40×30×20cm），并用繩子系著幾塊泡沫使其懸浮于池中。每個(gè)筐放入40只虎斑烏賊幼體（胴長(zhǎng)：1.41±0.05cm，體重：0.62±0.04g）。試驗(yàn)周期為30d，試驗(yàn)期間水體溫度在20～25℃，pH維持在7.50～8.00，連續(xù)充分曝氣。30d后每筐取存活烏賊幼體各10尾，去除墨囊，全程低溫操作。加入3mL生理鹽水，勻漿，4℃、3000r/min條件下冷凍離心機(jī)離心20min，取上清液用于酶活測(cè)定。

1.2.2 試驗(yàn)步驟 （1）將烏賊幼體分置養(yǎng)殖30d，處于6個(gè)鹽度環(huán)境，記錄烏賊幼體初始投入量（只），經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的養(yǎng)殖后記錄烏賊幼體存活量（只），算出存活率（%）;（2）在養(yǎng)殖不同鹽度下虎斑烏賊幼體30d的同時(shí)，記錄初始烏賊體重（g），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量烏賊幼體末的體重（g），最終根據(jù)烏賊幼體的特定生長(zhǎng)率公式計(jì)算出烏賊的生長(zhǎng)率SGR（%）：

（3）研究烏賊的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，探究6種不同鹽度梯度下的環(huán)境對(duì)虎斑烏賊幼體的免疫影響。本次試驗(yàn)通過(guò)超氧岐化酶活性（Superoxide Dismutase，SOD）來(lái)反映鹽度對(duì)其免疫調(diào)節(jié)的影響，采用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行總SOD活力（U/mgprot）測(cè)定，其定義每mg組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)反應(yīng)的SOD量為1個(gè)活力單位（U）[15-16]。

最后，利用IBM SPSS Statistics統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析、Turkey多重比較等進(jìn)行所得數(shù)據(jù)的一系列處理，作出不同鹽度與虎斑烏賊幼體存活率、特定生長(zhǎng)率和SOD活性的散點(diǎn)圖，用Excel表格做出相對(duì)應(yīng)的柱狀圖并標(biāo)上誤差，運(yùn)用SPSS軟件分析各組所得數(shù)據(jù)，以a-d作為標(biāo)簽表示平均值組間的差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對(duì)存活率的影響 由圖1可知，烏賊幼體在低鹽度17以下時(shí)不能生存，隨著鹽度的提升，烏賊能夠存活的數(shù)量越來(lái)越多。烏賊幼體的存活率隨鹽度的變化明顯波動(dòng)，當(dāng)鹽度范圍處于26～32時(shí)，幼體的存活率最高，說(shuō)明此時(shí)烏賊處于最適的鹽度范圍。經(jīng)回歸分析發(fā)現(xiàn)，最適鹽度為28.89。

2.2 鹽度對(duì)生長(zhǎng)率的影響 由圖2可知，隨著鹽度的升高，烏賊幼體末體重呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì);當(dāng)鹽度在23度以下時(shí)，烏賊體重顯著降低，在鹽度26～29時(shí)烏賊的體重達(dá)到頂峰;回歸分析發(fā)現(xiàn)，最適鹽度為28.17。不同鹽度對(duì)烏賊幼體的體重影響顯著（P<0.05）。

由圖3可知，烏賊幼體的生長(zhǎng)率SGR（%）隨鹽度的上升呈現(xiàn)出先高后低的趨勢(shì)，烏賊的生長(zhǎng)率在26和29鹽度時(shí)到達(dá)峰值，高達(dá)5.0左右。因此，可以推斷出鹽度范圍26～29滿足幼烏的最佳生長(zhǎng)要求。經(jīng)回歸分析發(fā)現(xiàn)，最適鹽度為27.97。

2.3 鹽度對(duì)SOD活性的影響 由圖4可知，隨著鹽度的變化，烏賊幼體的免疫調(diào)節(jié)也隨之下降。鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體內(nèi)SOD值影響顯著（P<0.05）?？梢钥闯?，在鹽度范圍20～32內(nèi)，鹽度20～23時(shí)，測(cè)得的SOD值最高，此時(shí)幼烏的免疫強(qiáng)度達(dá)到最高;鹽度29時(shí)，虎斑烏賊幼體內(nèi)SOD酶的活性較低。

3 討論與結(jié)論

鹽度脅迫對(duì)烏賊的生長(zhǎng)免疫具有重要的影響。鹽度過(guò)低時(shí)，烏賊幼體在進(jìn)食時(shí)較易出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)、噴墨等輕微抽搐現(xiàn)狀，逐漸死亡;當(dāng)鹽度處于正常時(shí)，出現(xiàn)的噴墨等現(xiàn)狀也趨于正常，可以通過(guò)自我免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)[17-18]。不同的烏賊對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍也有所不同，如虎斑烏賊適應(yīng)的鹽度為17～30，曼氏無(wú)針烏賊（Sepiella maindroni）適應(yīng)的鹽度范圍為12～32，擬目烏賊（Sepia lycidas）的適應(yīng)鹽度為21～33等[19]。本次試驗(yàn)結(jié)果得出，鹽度對(duì)虎斑烏賊幼體生存具有一定制約，幼體能夠適應(yīng)的鹽度范圍變化很大，當(dāng)鹽度過(guò)低（鹽度17）時(shí)，幼烏幾乎不能夠生存，活力不顯，反應(yīng)遲鈍直至死亡;鹽度在26～32時(shí)，30d后虎斑烏賊幼體的存活率為90.83%左右。文菁等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度為23、28、33條件下，虎斑烏賊幼體48h內(nèi)存活率較高，均愈80%。

試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度會(huì)影響虎斑烏賊的特定生長(zhǎng)率，當(dāng)鹽度處于20以下時(shí)，30d后烏賊的生長(zhǎng)率顯著下降，幼體很難存活與生長(zhǎng)。樂(lè)可鑫等研究發(fā)現(xiàn)，21d后鹽度21組的虎斑烏賊幼體特定生長(zhǎng)率處于最低值[18]。本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同鹽度實(shí)驗(yàn)30d后，在鹽度20～30范圍內(nèi)，虎斑烏賊幼體末體重及特定生長(zhǎng)率（SGR）均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì);當(dāng)鹽度在26～29時(shí)，烏賊的體重達(dá)到頂峰，特定生長(zhǎng)率為5.15～5.20%，產(chǎn)量最高。由SGR隨鹽度變化曲線圖可以看出，鹽度28左右，其生長(zhǎng)率達(dá)到最大值。

本次試驗(yàn)中，鹽度脅迫對(duì)虎斑烏賊免疫調(diào)節(jié)的影響是通過(guò)超氧化物歧化酶活性來(lái)反映的。超氧化物歧化酶是一種抗氧化金屬酶，能夠防御氧毒性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的鹽度層次下虎斑烏賊幼體的SOD酶活性的變化明顯。鹽度對(duì)SOD酶活性的影響與其對(duì)特定生長(zhǎng)率的影響不同，其變化趨勢(shì)呈現(xiàn)先下降后上升，鹽度在26～32時(shí)，SOD酶活性較低;在20～23時(shí)，SOD酶活性為62.53%～62.74%，幼體免疫抵抗最高。

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，不同鹽度試驗(yàn)后30d，在鹽度20～30范圍內(nèi)，虎斑烏賊幼體的存活率、末體重及特定生長(zhǎng)率（SGR）皆在鹽度26～29時(shí)達(dá)到頂峰。并且由存活率、SGR隨鹽度變化的曲線得出，鹽度為28左右時(shí)，存活率和生長(zhǎng)率到達(dá)最高點(diǎn);鹽度29時(shí)，烏賊幼體內(nèi)SOD酶活性較低。由此推測(cè)，虎斑烏賊幼體的最適鹽度在26～28。

參考文獻(xiàn)

[1]Jereb P，Roper C F E. Cephalopods of the world： An annotated and illustrated catalogue of cephalopod species known to date，volume 1. Chambered nautiluses and Sepioids（Nautilidae，Sepiidae，Sepiolidae，Sepiadariidae，Idiosephiidae and Spirulidae）[M]. Food and agriculture organization of the United Nations，2005.

[2]高曉蘭，蔣霞敏，樂(lè)可鑫，等.野生虎斑烏賊不同組織營(yíng)養(yǎng)成分分析及評(píng)價(jià)[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（12）：3858-3867.

[3]戴宏杰，孫玉林，馮梓欣，等.雌性虎斑烏賊纏卵腺營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué)，2016，37（14）：97-103.

[4]Minton J W，Walsh L S，Lee P G，et al. First multi-generation culture of the tropical cuttlefish Sepia pharaonis Ehrenberg，1831[J]. Aquaculture International，2001，9（5）：379-392.

[5]Jiang M，Ruan P，Peng R，et al. Effects of size dominance on the survival，growth and physiological activities of juvenile pharaoh cuttlefish（Sepia pharaonis）[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2020，525：1-9.

[6]樂(lè)可鑫，汪元，彭瑞冰，等.饑餓和再投喂對(duì)虎斑烏賊幼體存活、生長(zhǎng)和消化酶活力的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2016，27（06）：2002-2008.

[7]陳道海，王雁，梁漢青，等.虎斑烏賊（Sepia pharaonis）胚胎發(fā)育及孵化歷期觀察[J].海洋與湖沼，2012，43（02）：394-400.

[8]蔣霞敏，羅江，彭瑞冰，等.水泥池養(yǎng)殖條件下虎斑烏賊的生長(zhǎng)特性[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)（理工版），2014，27（02）：1-6.

[9]王雙健，丁玉惠，周爽男，等.虎斑烏賊噴墨卵與正常卵的比較[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2017，41（03）：366-373.

[10]Aewsiri T，Benjakul S，Visessanguan W. Functional properties of gelatin from cuttlefish（Sepia pharaonis） skin as affected by bleaching using hydrogen peroxide[J]. Food Chemistry，2008，115（1）：243-249.

[11]戴宏杰.虎斑烏賊肌肉糖蛋白分離純化、結(jié)構(gòu)分析及其抗氧化活性初步研究[D].杭州：浙江工商大學(xué)，2015.

[12]文菁，曹觀蓉，李施穎，等.環(huán)境因子對(duì)虎斑烏賊幼體存活率及行為的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2011，30（06）：321-324.

[13]黃建盛，陳剛，張健東，等.鹽度對(duì)虎斑烏賊（Sepia pharaonis）受精卵孵化及幼體活力的影響[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，32（01）：35-38.

[14]謝曉暉，黃國(guó)光，梁偉峰，等.虎斑烏賊幼體的攝食、排泄及不可逆點(diǎn)的研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26（04）：352-355.

[15]王凡，趙元鳳，呂景才，等.銅對(duì)牙鲆CAT、SOD和GSH-PX活性的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（06）：836-838.

[16]樊甄姣，夏靈敏，吳常文，等.亞硝酸氮對(duì)曼氏無(wú)針烏賊幼體的急性毒性及免疫系統(tǒng)的影響[J].河北漁業(yè)，2009（07）：8-11.

[17]Jiang M，Zhao C，Yan R X，et al. Continuous Inking Affects the Biological and Biochemical Responses of Cuttlefish Sepia pharaonis[J]. Frontiers in physiology，2019，10：1429.

[18]樂(lè)可鑫，蔣霞敏，彭瑞冰，等.4種生態(tài)因子對(duì)虎斑烏賊幼體生長(zhǎng)與存活的影響[J].生物學(xué)雜志，2014，31（04）：33-37.

[19]彭瑞冰，蔣霞敏，于曙光，等.幾種生態(tài)因子對(duì)擬目烏賊胚胎發(fā)育的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33（20）：6560-6568.

[20]楊衛(wèi)健，張雙全.超氧化物歧化酶的研究及應(yīng)用前景[J].淮陰師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，1（04）：82-86.

（責(zé)編：張宏民）