不同煙草品種接種蚜蟲后NtCPI1基因表達(dá)分析

孫計(jì)平 張慧敏 陳飛 孫煥 婁亞楠 李雪君 平文麗

摘 ?要：半胱氨酸蛋白酶抑制劑（CPI）與植物抗病抗蟲性密切相關(guān)，為了明確煙草半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因NtCPI1功能，研究其與煙草品種抗蟲性的關(guān)系，對(duì)不同蚜蟲抗性煙草品種進(jìn)行了接蟲前后NtCPI1熒光定量表達(dá)分析。結(jié)果表明，抗蚜煙草品種接種蚜蟲后，NtCPI1表達(dá)量顯著增加，664-01接種蚜蟲3 h后，NtCPI1表達(dá)量為對(duì)照的10.8倍，Blue River接種蚜蟲6 h后，NtCPI1表達(dá)量為對(duì)照的6.28倍;而螺絲頭2474、云煙97和中煙100等感蚜品種接蟲后，NtCPI1表達(dá)量極顯著降低。NtCPI1可以作為高效抗蚜候選基因，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：煙草;NtCPI;抗蚜蟲;表達(dá)

Analysis of NtCPI1 Gene Expression in Different Tobacco Varieties

SUN Jiping1， ZHANG Huimin1，2， CHEN Fei1， SUN Huan1， LOU Yanan1， LI Xuejun1*， PING Wenli1，

（1. Tobacco Research Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory for Green Preservation & Control of Tobacco Diseases and Pests in Huanghuai Growing Area， Xuchang， Henan 461000， China; 2. Pingdingshan academy of agricultural sciences， Pingdingshan， Henan 467000， China）

Abstract： Cysteine proteaseinhibitor（CPI） is closely related to plant disease and insect resistance. In order to clarify the function of tobacco CPI （NtCPI） and its relationship with tobacco resistance to aphids， the expression of NtCPI1in different tobacco varieties were analyzed by qRT-PCR before and after raphid infestation. The results of qRT-PCR showed that the expression of NtCPI1 gene in resistant tobacco varieties was significantly increased after infestation of aphids. The expression of NtCPI1in tobacco cultivar 664-01 after three hours of aphid infestation was 10.8 times higher than that in plants of control inoculation. The NtCPI1 expression in cultivar Blue River after six hours of aphid infestation was 6.28 times higher than that in plants of control inoculation. However， the expression of NtCPI1 in aphid susceptible cultivars， such as Luositou 2474， Yunyan 97 and Zhongyan 100， decreased significantly after insect infestation. NtCPI1 can be used as a highly effective anti-insect gene and has application potential.

Keywords： tobacco; NtCPI; aphid resistance; expression

煙蚜是煙草的主要害蟲之一，煙蚜發(fā)生數(shù)量大，危害時(shí)間長(zhǎng)，被危害煙葉烤后缺乏光澤，且易破碎。煙蚜分泌的“蜜露”又常導(dǎo)致煙葉發(fā)生“煤污病”，影響煙葉品質(zhì)，同時(shí)煙蚜的遷移為害，成為煙草多種病害尤其是黃瓜花葉病毒病的傳播媒介。很多半翅目、鞘翅目和同翅目蚜蟲均以巰基蛋白酶作為主要的消化酶[1-4]。半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine proteinase inhibitor， CPI）又稱巰基蛋白酶抑制劑，其生理作用是與巰基蛋白酶互相作用，調(diào)節(jié)機(jī)體蛋白酶的活性[5-6]，具有降解和儲(chǔ)存蛋白、抵抗生物或非生物脅迫的作用[7-8]。CPI對(duì)鞘翅目和半翅目昆蟲的消化酶有抑制作用。植物CPI通過與昆蟲腸中巰基蛋白酶形成蛋白酶-抑制劑復(fù)合物，抑制巰基蛋白酶水解作用，進(jìn)而降低昆蟲的消化功能，降低昆蟲攝食量，抑制昆蟲正常的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致昆蟲死亡[9-10]。水稻最早被確定含有植物同源CPI[11]，近年來，CPI的研究越來越引起人們廣泛關(guān)注[6]，CPI基因已經(jīng)在多種植物中得到了分離和鑒定，其中，大豆已經(jīng)鑒定出20個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因，柯丹霞等[12]對(duì)其中的GmCYS2基因進(jìn)行了功能驗(yàn)證。擬南芥受到甜菜胞囊線蟲感染后半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因AtCYS1、AtCYS5和AtCYS6表達(dá)量上升[13]。林世鋒等[6]從煙草中克隆了4個(gè)CPI基因的全長(zhǎng)cDNA序列（NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3、NtCPI4），研究認(rèn)為4個(gè)基因在根、莖、葉和芽中都有表達(dá)。王江英[9-10]等研究認(rèn)為過量表達(dá)山茶花CPI基因CaCPI的煙草蚜蟲抗性顯著提高，并認(rèn)為CaCPI與NtCPI1和NtCPI2序列比較接近。NtCPI與煙草品種蚜蟲抗性的關(guān)系研究較少，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，雖然NtCPI1和NtCPI2序列有很高的相似性，但轉(zhuǎn)錄組分析表明NtCPI1表達(dá)量較高，而NtCPI2幾乎不表達(dá)，說明在煙草中NtCPI1發(fā)揮主要作用。因此，本研究以不同煙蚜抗性煙草品種為試驗(yàn)材料，利用qRT-PCR分析了NtCPI1基因在接種蚜蟲后的表達(dá)量變化，進(jìn)一步明確NtCPI1的基因功能，為煙草抗蟲育種提供基因儲(chǔ)備和理論參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)時(shí)間、材料

試驗(yàn)于2019年3—5月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所實(shí)驗(yàn)室和網(wǎng)室進(jìn)行。供試煙草品種為云煙97、螺絲頭2474、中煙100、三八煙、K326、Blue River和664-01，均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

1.2 ?不同煙草品種蚜蟲抗性鑒定

參考周婷婷等[14]的葉碟法，研究煙蚜對(duì)不同煙草品種的選擇性;參考邱睿等[15]單頭飼養(yǎng)法，研究煙蚜在不同煙草品種上的繁殖特性和存活時(shí)間。

煙草品種抗蚜性評(píng)價(jià)參考“煙草品種抗蟲性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程”（YC/T509—2014）：高抗（i≤0.25）、抗（0.251.25）。抗蚜指數(shù)i取i1（煙蚜選擇性蚜量比）和i2（煙蚜繁殖量蚜量比）的均值。

1.3 ?煙草NtCPI1對(duì)接種蚜蟲的響應(yīng)

采用漂浮育苗培育煙苗，培養(yǎng)到4～5片真葉時(shí)移栽到花盆中，每個(gè)品種移栽12株，每盆1株。煙苗生長(zhǎng)到6～7片真葉時(shí)，每個(gè)品種選取有代表性植株9株接種蚜蟲，每株接種4齡無翅成蚜20頭，接蟲0，3，6，9和12 h分別取樣，每次每株取1/3片葉子，3株混合樣作為一個(gè)重復(fù)，錫箔紙包裹，立即投入液氮中冷凍，?80 ℃保存?zhèn)溆?，試?yàn)3次重復(fù)。

根據(jù)NtCPI1的cDNA序列設(shè)計(jì)定量PCR引物q-F和q-R，以煙草18S RNA作為內(nèi)參基因。引物序列及用途如表1所示，引物合成及測(cè)序工作由生工生物公司（武漢）完成。

以處理后各個(gè)樣品的cDNA為模板，樣本和內(nèi)參分別設(shè)置3次重復(fù)，以不作處理的樣品為對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照熒光定量試劑盒QuantiNova SYBR Green PCR Kit（QIAGEN）進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析。20 ?L反應(yīng)體系：依次加入SYBR Green PCR Master Mix 10 ?L，QN ROX Reference Dye 2 ?L，上下游引物各1 ?L，cDNA模板1 ?L，用ddH2O補(bǔ)充體系至20 ?L。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)得到的循環(huán)閾值（CT值），用2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)品種以未接蟲處理的對(duì)照表達(dá)量為1，每個(gè)品種基因的相對(duì)表達(dá)量為該品種接蟲后表達(dá)量與對(duì)照表達(dá)量的比值。

1.4 ?數(shù)據(jù)處理

采用DPS 14.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?不同煙草品種蚜蟲抗性比較

由表2可見，煙蚜成蟲對(duì)不同煙草品種的選擇性差異較大，664-01和三八煙，煙蚜選擇性低，蚜量比分別為0.25和0.28，這2個(gè)品種煙蚜數(shù)量極顯著低于其他品種;Blue River蚜量比也小于0.5;螺絲頭2474煙蚜選擇性最高，煙蚜數(shù)量顯著高于其他品種，蚜量比為1.50，云煙97和中煙100煙蚜選擇性也較高，蚜量比分別為1.20和1.21。煙蚜成蟲對(duì)不同煙草品種有明顯的取食選擇性。

不同煙草品種煙蚜繁殖量差異較大，螺絲頭2474和云煙97煙蚜繁殖量極顯著高于其他品種，煙蚜繁殖量蚜量比分別為1.32和1.18;Blue River煙蚜繁殖量最少，極顯著低于其他品種;其次是664-01和K326，蚜量比分別為0.45和0.52。

從不同煙草品種煙蚜存活時(shí)間比較來看，煙蚜在云煙97葉片上存活時(shí)間最長(zhǎng)，其次為螺絲頭2474，煙蚜在Blue River上存活時(shí)間最短。

根據(jù)煙草品種抗蟲性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程（YC/T509—2014），參考煙蚜存活時(shí)間，初步判定Blue River和664-01為抗蚜品種，三八煙和K326煙蚜抗性為中，云煙97、螺絲頭247和中煙100為感蚜品種。

2.2 ?接種蚜蟲前后NtCPI1表達(dá)量對(duì)比分析

接種煙蚜后，qRT-PCR分析顯示（圖1），NtCPI1在不同煙草品種中的表達(dá)量差異較大。抗蚜煙草品種664-01，接蚜蟲3 h后，NtCPI1表達(dá)量迅速增加，為對(duì)照的10.8倍，之后表達(dá)量下降，但在接蟲后3～12 h，NtCPI1相對(duì)表達(dá)量均超過2，極顯著高于對(duì)照。上述結(jié)果表明，664-01在遇到蚜蟲侵襲后迅速做出應(yīng)對(duì)反應(yīng)，NtCPI1基因表達(dá)量迅速增加。

抗蚜煙草品種Blue River，接種煙蚜3 h后，NtCPI1基因表達(dá)量為對(duì)照的2.14倍，極顯著高于對(duì)照;接種蚜蟲6 h后，NtCPI1表達(dá)量提高6.28倍;之后表達(dá)量下降，接蟲后9和12 h，NtCPI1相對(duì)表達(dá)量均超過1，但與對(duì)照差異不顯著。與煙草品種664-01相比，Blue River在遇到蚜蟲侵襲后反應(yīng)延遲，但明顯超過其他幾個(gè)品種。

螺絲頭2474、云煙97和中煙100等感蚜品種接蟲后NtCPI1表達(dá)量均極顯著降低。

蚜蟲抗性為“中”的品種K326和三八煙接蟲6 h后，NtCPI1相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的5.75倍和1.86倍，極顯著高于對(duì)照。

3 ?討 ?論

植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑是植物體內(nèi)廣泛存在的一種防御蛋白，是一類可逆抑制蛋白，前人研究表明，植物CPI在抗蟲方面起重要作用，作用的途徑主要是被昆蟲攝食后，昆蟲體內(nèi)蛋白酶和消化酶活性受到抑制，由于缺乏必需氨基酸的供應(yīng)，進(jìn)食困難，最終導(dǎo)致昆蟲的非正常發(fā)育或死亡[9，16-21]。

CPI在多種植物中被克隆，但研究重點(diǎn)一直集中在生物信息學(xué)分析方面，CPI與植物抗性之間聯(lián)系的研究相對(duì)較少，柯丹霞等[12]采用轉(zhuǎn)基因過表達(dá)的方法，說明GmCYS2蛋白具有一定的酶活性抑制作用，并且正調(diào)控百脈根共生結(jié)瘤過程;前人將豇豆絲氨酸蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙芽夜蛾和煙草天蛾有毒殺和抑制作用[22]。MASOUD等[23]將水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入煙草，但未報(bào)道轉(zhuǎn)基因煙草是否獲得了抗蟲活性。林世鋒等[21]進(jìn)行煙草CPI基因家族的克隆，但未進(jìn)一步研究基因功能及其與煙草抗蟲性的關(guān)系。王江英等[9-10]研究認(rèn)為轉(zhuǎn)CaCPI煙草蚜蟲抗性明顯提高，且CaCPI與NtCPI1和NtCPI2序列比較接近。

在遇到蚜蟲侵襲條件下，煙草自身CPI基因表達(dá)量變化研究較少，本研究選用不同煙草品種為試驗(yàn)材料，煙蚜選擇性試驗(yàn)和繁殖量試驗(yàn)結(jié)果表明，云煙97、螺絲頭2474和中煙100煙蚜選擇性和繁殖量均較高，云煙97和中煙100抗蚜指數(shù)分別為1.18和1.05，為感蚜品種;螺絲頭2474抗蚜指數(shù)為1.32，為高感品種，這與邱睿等[15]、周婷婷等[14]研究結(jié)果基本一致;Blue River和664-01為抗蚜品種，三八煙和K326煙蚜抗性鑒定結(jié)果為中。熒光定量分析結(jié)果表明，接種蚜蟲后，不同煙草品種NtCPI1表達(dá)量差異較大，抗蚜煙草品種664-01接種蚜蟲后NtCPI1表達(dá)量顯著增加，接蟲3 h后為對(duì)照的10.8倍，且在接蟲6～12 h NtCPI1表達(dá)量均顯著高于對(duì)照;抗蚜煙草品種Blue River接種蚜蟲6 h后，NtCPI1表達(dá)量為對(duì)照的6.28倍;而高感品種螺絲頭2474、感蚜品種云煙97和中煙100接蟲后NtCPI1表達(dá)量極顯著降低。蚜蟲侵襲煙草葉片后，抗蚜品種NtCPI1基因表達(dá)量迅速增加，因此，NtCPI1可以作為高效抗蚜候選基因，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

植物CPI能夠發(fā)揮抑制作用，有3個(gè)基本結(jié)構(gòu)是必須的：N末端的甘氨酸殘基G，高保守序列QVVXG以及C末端的W[9-10]。林世鋒等[6]克隆了NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3、NtCPI4等4個(gè)基因，分別編碼98，98，120，123個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，都具有CPI反應(yīng)位點(diǎn)的保守序列及植物CPI所特有的基序。本研究只對(duì)蚜蟲入侵后不同煙草品種NtCPI1基因表達(dá)量進(jìn)行了初步研究，煙草CPI在適應(yīng)生物和非生物脅迫過程中的通路調(diào)節(jié)過程等仍需進(jìn)一步的研究，通過NtCPI基因在煙草中的過表達(dá)及RNAi干擾工作，進(jìn)一步證實(shí)NtCPI與煙草抗蟲性之間的聯(lián)系。

4 ?結(jié) ?論

抗蚜煙草品種Blue River和664-01接種蚜蟲后NtCPI1表達(dá)量顯著增加;高感蚜蟲煙草品種螺絲頭2474、感蚜煙草品種云煙97和中煙100接種蚜蟲后NtCPI1表達(dá)量顯著降低;NtCPI1可以作為高效抗蚜候選基因，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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基金項(xiàng)目：河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目“煙草抗蚜蟲種質(zhì)資源篩選和抗蟲機(jī)理的研究”（2019ZC19，2020ZC17）

作者簡(jiǎn)介：孫計(jì)平（1978-），女，博士，助理研究員，研究方向?yàn)闊煵葸z傳育種與分子生物學(xué)。E-mail：sunjiping2002@126.com

*通信作者，E-mail：lixuejun8373@163.com

收稿日期：2019-09-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 修回日期：2019-12-15