微生物-石墨烯聯(lián)合強(qiáng)化畜禽養(yǎng)殖廢水處理研究

張 超，李 靜，宋志斌，白 潔，胡麗君，公衍麗，吳 迪，陳峻峰，劉 凱

（曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東曲阜273165）

畜禽養(yǎng)殖廢水具有COD、氮、磷、懸浮物（SS）以及致病菌含量高并伴有惡臭、水質(zhì)水量變化大、處理難度大等特點(diǎn)。對(duì)于這類復(fù)合污染水體，如果不進(jìn)行合理的處置，直接外排將會(huì)對(duì)周邊環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，甚至嚴(yán)重威脅人體的健康〔1〕。

我國傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖廢水處理方式主要有自然處理法、生物處理法、物化處理法等〔2〕。自然處理法占地面積大，容易受到外部環(huán)境變化的不良影響，而且存在污染地下水的風(fēng)險(xiǎn)〔3〕；生物處理法受水質(zhì)、水量的影響較大，且對(duì)廢水濃度有一定的要求〔4〕；物化處理法對(duì)于畜禽養(yǎng)殖廢水中COD、氨氮、重金屬均有一定的去除能力，但作為單獨(dú)處理工藝，凈化效果尚有欠缺，不適用于大規(guī)模的廢水處理〔5〕。

針對(duì)上述情況，本研究以黃假單胞菌Pseudomonas flavaWD-3與氧化石墨烯（GO）構(gòu)建微生物-納米材料聯(lián)合處理體系的新思路。其中，Pseudomonas flavaWD-3是從山東省南四湖人工濕地中分離篩選出來的耐性菌，在低溫條件下仍可對(duì)人工濕地廢水中的COD以及氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有明顯的去除效果，平均去除效率分別為未投加該菌的 1.5～1.8倍〔6〕，在污水治理中具有良好的應(yīng)用前景和很大的發(fā)展空間。同時(shí)，近年來石墨烯材料以其獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的性能在水處理等領(lǐng)域的應(yīng)用引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注〔7〕。GO作為石墨烯的重要派生物，其表面含有豐富的含氧官能團(tuán)，具有性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積高（2 630 m2/g）、親水性強(qiáng)、表面易于進(jìn)行功能化以及可實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用等優(yōu)點(diǎn)〔8〕，而且價(jià)格較石墨烯相對(duì)便宜，被認(rèn)為是水處理技術(shù)的理想材料，具有重要的科研價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。

本研究通過在常溫條件下向豬場(chǎng)養(yǎng)殖廢水中投加Pseudomonas flavaWD-3菌懸液和GO溶液，獲得了其最佳的投加比例，原位制得了石墨烯納米顆粒，同步考察了廢水中COD、NH4+-N、TN、TP的變化，以Pseudomonas flavaWD-3和GO單一處理體系作參比，探究了微生物-納米材料聯(lián)合體系對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水的處理效果、作用周期和去除機(jī)理，為畜禽養(yǎng)殖廢水處理提供了新思路，對(duì)農(nóng)業(yè)面源污染控制和水環(huán)境生態(tài)治理具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1Pseudomonas flavaWD-3菌懸液的制備

接種4℃斜面保存的Pseudomonas flavaWD-3菌株于30℃下活化24 h后，轉(zhuǎn)接至100 mL的LB液體培養(yǎng)基中于22～25℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 （24～36 h）， 然后在22℃、3 000 r/min下進(jìn)行離心，去除培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分。收集菌體細(xì)胞，取濕菌體細(xì)胞置于無菌水中制備成菌懸液，在600 nm波長(zhǎng)下其吸光度為1.0～1.2，菌懸液的濃度為4.575×108mL-1〔9〕。

1.1.2 GO溶液的制備

石墨的預(yù)處理：在圓底燒瓶?jī)?nèi)，將50 mL濃硫酸加熱到90℃，連續(xù)攪拌（250 r/min），緩慢依次少量分別加入10 g過硫酸鉀和10 g五氧化二磷，至完全溶解?；旌衔锢鋮s至80℃。在劇烈攪拌下（400 r/min），緩慢加入12 g石墨，在80℃下反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后停止加熱并冷卻至室溫，將圓底燒瓶?jī)?nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)移至大燒杯中，加入2 L去離子水稀釋，靜置12 h以上。將上清液倒出，抽濾洗滌至濾液呈中性。將固體轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于鼓風(fēng)干燥箱中100℃下干燥12 h以上。取出樣品冷卻至室溫后，將其存放于真空干燥器中。

GO 溶液的制備：采用改進(jìn) Hummers法〔10〕。 將100 mL冰的濃硫酸加入至圓底燒瓶。在10℃下，取3 g預(yù)處理的石墨加入至冰的濃硫酸中攪拌均勻，將15 g高錳酸鉀在劇烈攪拌下緩慢加入至冰的濃硫酸中，密切監(jiān)控水浴溫度不超過10℃。加完高錳酸鉀后，整個(gè)混合物在50℃下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合物緩慢倒入裝有200 g冰塊的燒杯中，邊緩慢攪拌邊加入，防止其局部溫度過高。將此混合物攪拌2 h，再加入2 L去離子水稀釋，后加入12 mL雙氧水。攪拌完全后靜置24 h，倒去上清液。用10%的鹽酸溶液洗滌樣品，直到樣品溶液離心后的上清液加入BaCl2后不會(huì)產(chǎn)生白色沉淀為止。然后用水離心處理至中性，加入一定量的去離子水，超聲剝離后即為GO。將其配制成不同濃度，冷凍保藏備用。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)水樣的確定

量取少量從養(yǎng)殖場(chǎng)獲得的豬場(chǎng)養(yǎng)殖廢水經(jīng)自然沉淀后分別稀釋10倍、20倍、50倍、100倍，控制pH為7左右，測(cè)定COD，最終確定50倍稀釋水樣（COD為500 mg/L左右）作為實(shí)驗(yàn)水樣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PseudomonasflavaWD-3菌懸液處理廢水研究

根據(jù)唐美珍等〔11〕的研究，選定投菌量即V（菌懸液）/V（水樣）為1.5%～10%。在常溫條件下，首先設(shè)置1.5%、4%、6%、8%、10%5個(gè)梯度，分別配制3 L水樣處理系統(tǒng)，以投加菌懸液0 h（剛加入菌懸液）時(shí)廢水水樣中COD、NH4+-N、TN、TP的質(zhì)量濃度做參比，每隔24 h進(jìn)行取樣測(cè)定，追蹤各污染物質(zhì)量濃度變化，獲得該梯度設(shè)置下的最佳投菌量和作用效果趨勢(shì)。然后以該投菌量為中心縮小梯度范圍，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，獲得PseudomonasflavaWD-3對(duì)養(yǎng)殖廢水中各污染物的去除率和最佳投菌量作用周期。

1.2.2Pseudomonas flavaWD-3菌懸液與GO溶液最佳投加比例探究

常溫條件下，同時(shí)投加所得最佳投菌量的Pseudomonas flavaWD-3菌懸液與GO溶液于水樣中獲得0、0.5、1.0、1.5 mg/L不同GO溶液濃度梯度的3 L水樣處理系統(tǒng)，以投加菌懸液與GO溶液0 h時(shí)廢水水樣中COD、NH4+-N、TN、TP的質(zhì)量濃度做參比，每隔24 h進(jìn)行取樣測(cè)定，追蹤水樣處理系統(tǒng)中各污染物質(zhì)量濃度的變化，分析獲得二者的最佳投加比例，確定為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的聯(lián)合處理體系。

1.2.3Pseudomonas flavaWD-3-GO聯(lián)合體系處理廢水研究

保持前期實(shí)驗(yàn)條件不變，將上一階段所得聯(lián)合體系加入3 L水樣處理系統(tǒng)中，以相同投加量的Pseudomonas flavaWD-3和GO單一處理體系作參比，考察水樣中 COD、NH4+-N、TN、TP的變化，獲得該聯(lián)合體系對(duì)養(yǎng)殖廢水的處理效果和作用周期。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的石墨烯與所用GO進(jìn)行X射線衍射和拉曼光譜分析以及對(duì)所得石墨烯進(jìn)行電鏡掃描分析，探究聯(lián)合體系對(duì)養(yǎng)殖廢水的去除機(jī)理。

1.2.4 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定方法

總氮的測(cè)定采用堿性過硫酸鉀紫外分光光度法；氨氮的測(cè)定采用納氏試劑分光光度法；COD的測(cè)定硫酸亞鐵銨滴定法；總磷的測(cè)定采用鉬酸銨分光光度法。各指標(biāo)測(cè)定的具體操作步驟詳見《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》（第4版）。

2 結(jié)果與結(jié)論

2.1 Pseudomonas flava WD-3對(duì)污染物的去除效果和最佳投菌量的作用周期

通過對(duì)1.5%、4%、6%、8%、10%5個(gè)梯度Pseudomonas flavaWD-3處理體系中4種污染物的連續(xù)追蹤測(cè)定，發(fā)現(xiàn)8%的Pseudomonas flavaWD-3菌懸液對(duì)水樣處理效果較前3個(gè)梯度更加明顯并且接近甚至超過10%處理體系，因此再次設(shè)置了6%、7%、8%、9%、10%5個(gè)梯度，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終得到了不同梯度Pseudomonas flavaWD-3的菌懸液對(duì)養(yǎng)殖廢水中各污染物的最大去除率，結(jié)果見表1。

表1 4種污染物的進(jìn)水參數(shù)和不同梯度菌懸液處理體系的最大去除率

由表1可知，隨著投菌量的增加，4種污染物的去除率基本呈上升趨勢(shì)；投菌量為6%～7%時(shí)，去除率均有明顯的增加（TP最為明顯），而由7%到10%各污染物的去除率相差不大，綜合考慮各方面因素，確定最佳投菌量為7%，對(duì)水樣中COD、NH4+-N、TN、TP的去除率分別為25.72%、19.98%、21.76%、27.66%。

通過連續(xù)1周的追蹤測(cè)定，獲得了7%Pseudomonas flavaWD-3菌懸液處理體系中4種污染物的變化趨勢(shì)，結(jié)果見圖1。

圖1 菌懸液處理體系中污染物的去除效果

由圖1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各污染物的質(zhì)量濃度呈先下降后上升的趨勢(shì)，在第2 d或第3 d降至最低，即去除率達(dá)到最大，3 d后質(zhì)量濃度開始明顯上升。因此，在單一菌懸液處理體系中選作用周期為3 d為宜。

2.2 Pseudomonas flava WD-3菌懸液與GO溶液的最佳投加比例

保持Pseudomonas flavaWD-3 7%的最佳投菌量不變，向廢水中投加不同濃度梯度的GO溶液，考察4種污染物的最大去除率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度GO溶液對(duì)各污染物去除效果的影響

由圖2可知，隨著GO溶液濃度的增加，對(duì)COD、NH4+-N、TN、TP的最大去除率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)GO溶液質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/L之后，繼續(xù)增大GO溶液質(zhì)量濃度至1.5 mg/L，其最大去除率變化不大。因此，綜合考慮去除率、處理成本等因素，最終確定聯(lián)合體系的最佳投加比例為7%的Pseudomonas flavaWD-3菌懸液和1 mg/L的GO溶液。

2.3 聯(lián)合體系對(duì)養(yǎng)殖廢水的處理效果和作用周期

以Pseudomonas flavaWD-3和GO單一處理體系作參比，考察7%Pseudomonas flavaWD-3菌懸液與1 mg/L GO溶液聯(lián)合體系對(duì)養(yǎng)殖廢水中4種污染物的去除效果，結(jié)果見圖3。

圖3 不同處理體系對(duì)4種污染物的去除效果

由圖3可知，在1～2 d，由于GO對(duì)微生物的抑制作用〔12〕，聯(lián)合體系對(duì)各污染物的去除率接近甚至低于GO單一處理體系；在2～3 d，Pseudomonas flavaWD-3逐漸適應(yīng)環(huán)境，并且通過菌株自身及其所產(chǎn)生的酶在電子介質(zhì)的作用下將GO原位還原形成了石墨烯〔13〕，同時(shí)由于還原GO表面有豐富的π電子結(jié)構(gòu)，更易于π-π共軛鍵的形成，進(jìn)一步提高了聯(lián)合體系對(duì)污染物的吸附降解作用〔14〕，使得該體系在第3 d對(duì)COD、NH4+-N、TN、TP的去除率達(dá)到最大，分別為 82.24%、56.06%、57.73%、70.00%，為僅投加Pseudomonas flavaWD-3菌懸液（25.72%、19.98%、21.76%、27.66%）的 3.17、2.74、2.95、3.19 倍和僅投加 GO 溶液（58.44%、34.53%、32.26%、44.41%）的1.42、1.59、1.62、1.58 倍，達(dá)到了“1+1＞2”的處理效果，同時(shí)出水滿足畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18596—2001）；而在 4～6 d，聯(lián)合體系對(duì)各污染物的去除率逐漸下降并且趨于穩(wěn)定，處理效果仍然高于GO單一處理體系，由此推測(cè)在第3 d，聯(lián)合處理體系中可能存在2種共存情況：Pseudomonas flavaWD-3和還原氧化石墨烯（rGO）共存或Pseudomonas flavaWD-3、GO、rGO三者共存。綜合考慮時(shí)間及實(shí)驗(yàn)成本等問題，選用3 d為作用周期。

2.4 聯(lián)合體系對(duì)養(yǎng)殖廢水的去除機(jī)理

Pseudomonas flavaWD-3原位還原GO結(jié)構(gòu)和形貌特征分析見圖4。

圖4 Pseudomonas flava WD-3原位還原GO的結(jié)構(gòu)和形貌特征分析

圖4 （a）是GO和石墨烯的XRD圖譜，GO的峰值出現(xiàn)在 10.5°（〔001〕晶面），而石墨烯的此峰消失，而在26.6°和32.7°出現(xiàn)了相對(duì)明顯的峰，這與J.Chen等〔15〕采用混合微生物原位還原結(jié)果類似，表明GO大部分被Pseudomonas flavaWD-3原位還原。

圖 4（b）是 GO和石墨烯的拉曼光譜圖，在1 342 cm-1處的D峰反映的是碳原子sp3雜化結(jié)構(gòu)，反映石墨烯的缺陷度和混亂度，在1 582 cm-1處的G峰反映的是碳原子sp2雜化結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)。D峰和G峰強(qiáng)度比（ID/IG）可以用來表征石墨烯的石墨化程度或無序化程度。圖4（b）中GO和石墨烯的ID/IG從0.76增加到0.94，這表明經(jīng)Pseudomonas flavaWD-3原位還原得到的石墨烯的無序程度增大，石墨烯內(nèi)部可以提供更多的缺陷位點(diǎn)，ID/IG的增大也可說明石墨烯π-π共軛狀態(tài)得以擾亂〔16〕。

圖4（c）是石墨烯的SEM圖，可以觀察到石墨烯具有明顯的層狀結(jié)構(gòu)，隨機(jī)堆疊，出現(xiàn)褶皺和彎曲的形貌結(jié)構(gòu)，這是由于其含氧官能團(tuán)的減少，使得石墨烯層與層之間因范德華力的作用而易于團(tuán)聚，石墨烯的這種堆疊方式利于增大其比表面積。

圖4（d）是石墨烯的TEM圖，可以看出石墨烯呈透明片狀結(jié)構(gòu)，表面平滑，邊緣具有褶皺，微生物還原所得石墨烯是單層或少層的，其厚度約為1 nm。

GO被PseudomonasflavaWD-3成功還原是由于養(yǎng)殖廢水在厭氧條件下被Pseudomonas flavaWD-3代謝，在微生物胞內(nèi)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生還原產(chǎn)物和氧化產(chǎn)物，電子受體間接或直接地接收糖酵解和細(xì)胞呼吸作用產(chǎn)生的還原型輔酶（NADH）所攜帶的電子后生成還原產(chǎn)物，在此過程中會(huì)產(chǎn)生還原力或還原作用氧化。在這一過程中不僅Pseudomonas flavaWD-3會(huì)利用養(yǎng)豬廢水中的碳氮磷等物質(zhì)合成自身所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且還原過程也需消耗廢水中的營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而使得水體中COD、NH4+-N、TN、TP的處理效果得以提升；圖4表明經(jīng)Pseudomonas flavaWD-3還原后的石墨烯具有與化學(xué)還原法得到相類似的結(jié)構(gòu)，可以充分發(fā)揮石墨烯自身的催化能力協(xié)同Pseudomonas flavaWD-3強(qiáng)化對(duì)養(yǎng)殖廢水的處理效果；且石墨烯具有巨大的比表面積使其具有很強(qiáng)的吸附能力，使得養(yǎng)殖廢水中的COD、NH4+-N、TN和TP得以進(jìn)一步去除。

3 結(jié)論

（1）Pseudomonas flavaWD-3單一體系處理養(yǎng)殖廢水的最佳投菌量為7%，此時(shí)Pseudomonas flavaWD-3對(duì)水樣中 COD、NH4+-N、TN、TP的去除率分別為25.72%、19.98%、21.76%、27.66%，作用周期為 3 d。

（2）聯(lián)合體系的最佳投加比例為7%的Pseudomonas flavaWD-3菌懸液和1 mg/L的GO溶液，對(duì)COD、NH4+-N、TN、TP的最大去除率分別為82.24%、56.06%、57.73%、70.00%，為僅投加Pseudomonas flavaWD-3 菌懸液的 3.17、2.74、2.95、3.19 倍和僅投加GO 溶液的 1.42、1.59、1.62、1.58 倍。

（3）7%的Pseudomonas flavaWD-3菌懸液和 1 mg/L GO聯(lián)合體系對(duì)養(yǎng)殖廢水的作用周期為3 d，此時(shí)廢水中COD、NH4+-N、TN和TP去除率達(dá)到最大值，同時(shí)出水滿足畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)（GB 18596—2001）。

（4）GO大部分被Pseudomonas flavaWD-3成功原位還原，所得石墨烯與化學(xué)還原所得石墨烯的性能接近，石墨烯具協(xié)同Pseudomonas flavaWD-3強(qiáng)化養(yǎng)殖廢水處理效果，且石墨烯具有很強(qiáng)的吸附能力，使得養(yǎng)殖廢水中的COD、NH4+-N、TN和TP得以高效去除。