自噬對(duì)卡培他濱結(jié)腸癌體外化療效果的影響及機(jī)制探討*

陳志航，顧智文，高楓，張森，張小龍

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，目前主要以手術(shù)治療為主，對(duì)于中晚期患者，除了手術(shù)治療同時(shí)也需要化療來改善療效?？ㄅ嗨麨I是目前首選的一線化療藥物之一[1]，具有較好的單藥治療效果和聯(lián)合化療效果，但是其療效依然有限，對(duì)部分患者效果不佳，會(huì)產(chǎn)生耐藥性。進(jìn)一步探究如何提高卡培他濱的化療效果，探索以卡培他濱為基礎(chǔ)的新型化療方案具有重要的臨床價(jià)值。細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過程，通過自噬，一些損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，進(jìn)入溶酶體中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用[2]。有研究表明：細(xì)胞自噬的激活會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)效果，阻止其發(fā)生凋亡，自噬可以幫助腫瘤細(xì)胞耐受或阻止化療藥物毒性所引起的細(xì)胞破壞，而抑制細(xì)胞的自噬將削弱這一保護(hù)效應(yīng)[3]。因此探索細(xì)胞自噬與腫瘤之間的關(guān)系有助于探索更有效的腫瘤治療方法。本研究目的是在體外實(shí)驗(yàn)中探究在細(xì)胞自噬抑制或激活后，卡培他濱對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 增殖與凋亡的影響，從而為尋找更加有效的以卡培他濱為基礎(chǔ)的化療方案提供新的思考方向，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基與澳洲胎牛血清購自美國(guó)Gibco 公司；胰酶、二甲基亞砜、雙抗-青鏈霉素混合液均購自北京索萊寶公司；卡培他濱（capecitabine，CAP）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）與雷帕霉素（rapamycin，RAPA）均購自美國(guó)MedChemExpress公司；CCK8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；MTT試劑盒、Western-bolt 實(shí)驗(yàn)相關(guān)材料購自中國(guó)碧云天公司；AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購自美國(guó)BD 公司；Beclin-1、LC3 兔抗人單克隆抗體均購自美國(guó)CST公司；Bcl2與Bax兔抗人單克隆抗體購自美國(guó)Abcam 公司；山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 680 購自賽默飛世爾科技公司；mCherry-GFP-LC3 雙標(biāo)腺病毒購自上海吉?jiǎng)P基因公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司；酶標(biāo)儀購自美國(guó)伯騰公司；雙色紅外成像系統(tǒng)購自美國(guó)LI-COR 公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon 公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116 購自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。HCT-116 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含有100 mL/L 胎牛血清并添加100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，并置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)分為無細(xì)胞不加藥僅含培養(yǎng)基的空白對(duì)照組（A空白組）、含細(xì)胞和培養(yǎng)基不加藥的對(duì)照組（A對(duì)照組）和加藥（CAP濃度分別0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L）的實(shí)驗(yàn)組（A加藥組）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116 細(xì)胞接種于96 孔板中，約1×105個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度的CAP，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后加入CCK8溶液，每孔10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（A 對(duì)照-A 加藥）/（A 對(duì)照-A空白）×100%。

1.2.3 Western-blot 檢測(cè)細(xì)胞蛋白濃度變化 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116 細(xì)胞70%～80%的密度接種于6孔板上，按不加藥空白對(duì)照組與加藥（CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）組處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。去掉培養(yǎng)基后加入RIPA 裂解液冰上裂解30 min，收集液體后13 000 rpm 4 ℃離心30 min。蛋白用8%～15%SDS-PAGE 凝膠電泳分離，半干法轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗（1:1 000）4 ℃搖床過夜，加入熒光二抗（1:5 000）室溫孵育1 h后使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描檢測(cè)蛋白（分別為Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bax、Bcl2以及內(nèi)參GAPDH）變化情況。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)分為無細(xì)胞不加藥僅含培養(yǎng)基的空白對(duì)照組（B 空白組）、含細(xì)胞和培養(yǎng)基不加藥的對(duì)照組（B 對(duì)照組） 和加藥（CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）的實(shí)驗(yàn)組（B 加藥組）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116 細(xì)胞接種于96 孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后加藥,每組3 個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h 后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=（B 加藥-B 空白）/（B 對(duì)照-B 空白）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)分為不加藥的空白對(duì)照組和加藥（CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）的實(shí)驗(yàn)組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡雙染試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行操作，PBS 洗滌重懸并離心細(xì)胞2 次，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞后，加入5 μL AnnexinV-FITC輕輕混勻，閉光孵育15 min后加入PI染料繼續(xù)孵育5 min，最后補(bǔ)加400 μL 1×Binding Buffer后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 mCherry-GFP-LC3自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116 細(xì)胞接種于24 孔板中。mCherry-GFP-LC3 質(zhì)粒使用制造商推薦的Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）轉(zhuǎn)染至HCT-116細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 等待細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（不使用藥物）與加藥組（分別加入CAP、CAP+3-MA、CAP+RAPA）。之后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用激光共聚焦顯微鏡拍攝并分析對(duì)照組與加藥組的自噬流變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用GraphPad Prism 6.01作圖。計(jì)量資料以（xˉ±s）表示，兩組組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 卡培他濱對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞增殖的影響

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，HCT-116細(xì)胞在不同濃度（0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4 mmol/L、5 mmol/L）的CAP 分別作用12 h、24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，且CAP 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 的生長(zhǎng)抑制作用具有濃度依賴關(guān)系，并且與作用時(shí)間相關(guān)，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，在4 mmol/L 時(shí)達(dá)到最大效果。而藥物作用時(shí)間在48 h 時(shí)達(dá)到最大抑制效果（見圖1）。由于CAP 濃度過低會(huì)導(dǎo)致凋亡效果不明顯，而濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過多，無法反應(yīng)抑制或激活細(xì)胞自噬后凋亡的變化情況，經(jīng)計(jì)算CAP 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的IC50約在2.142 mmol/L，因此使用2 mmol/L的CAP作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

圖1 CCK8檢測(cè)CAP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的細(xì)胞增抑制率

2.2 3-MA、RAPA對(duì)HCT-116細(xì)胞自噬的作用

使用不同濃度（0 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L）的3-MA處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，48 h后提取細(xì)胞中的蛋白，采用Western-blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與Beclin-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用3-MA處理HCT-116細(xì)胞后LC3與Beclin-1蛋白的表達(dá)降低，且隨著藥物濃度的升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ與Beclin-1蛋白的表達(dá)降低更加明顯（見圖2）。使用不同濃度（0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L）的RAPA處理HCT-116細(xì)胞48 h。Western-blot結(jié)果提示RAPA可引起腸癌細(xì)胞HCT-116中LC3與Beclin-1蛋白表達(dá)升高，且隨著藥物濃度升高蛋白表達(dá)量升高（見圖3）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出3-MA可抑制HCT-116細(xì)胞自噬的發(fā)生，RAPA可激活HCT-116細(xì)胞的自噬，經(jīng)計(jì)算3-MA在結(jié)腸癌細(xì)胞中的IC50約為3.798 mmol/L，而RAPA在結(jié)腸癌細(xì)胞中的IC50約為94.633 nmol/L，根據(jù)結(jié)果后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用4 mmol/L的3-MA與100 nmol/L的RAPA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 3-MA對(duì)HCT-116細(xì)胞自噬的作用

圖3 RAPA對(duì)HCT-116細(xì)胞自噬的作用

2.3 不同用藥組的HCT-116細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl2與Bax的表達(dá)

Western-blot 蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，單獨(dú)使用CAP時(shí)，Bcl2/Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組下降，表明此時(shí)細(xì)胞凋亡增加；CAP+3-MA 組的Bcl2/Bax 蛋白表達(dá)較CAP 組的Bcl2/Bax 蛋白表達(dá)出現(xiàn)了明顯下降，說明此時(shí)細(xì)胞的凋亡相較于CAP 組增多；CAP+RAPA 組的Bcl2/Bax 蛋白表達(dá)較CAP 組升高，說明細(xì)胞凋亡相較于CAP組減少（見圖4）。

圖4 不同用藥組的HCT-116細(xì)胞中凋亡蛋白Bcl2與Bax的表達(dá)

2.4 3-MA及RAPA對(duì)卡培他濱引起的細(xì)胞自噬作用的影響

將mCherry-GFP-LC3 自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染至HCT-116 細(xì)胞，使HCT-116 細(xì)胞中可觀察到不同的熒光信號(hào)。在非自噬情況下mCherry-GFP-LC3 以彌散的黃色熒光形式存在，而在發(fā)生自噬的情況下mCherry-GFP-LC3 以聚集的黃色斑點(diǎn)的形式存在。使用不同藥物處理轉(zhuǎn)染后的HCT-116 細(xì)胞48 h 后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞?？梢杂^察到，不使用任何藥物時(shí)黃色熒光處于彌散狀態(tài)，細(xì)胞自噬并不活躍；單獨(dú)使用CAP 時(shí)黃色熒光部分聚集，說明細(xì)胞自噬被CAP 激活；3-MA+CAP 組黃色熒光聚集減少，表明3-MA 可抑制CAP 引起的細(xì)胞自噬；而RAPA 與CAP 共同作用于HCT-116 細(xì)胞時(shí)黃色熒光大量聚集，自噬體比單獨(dú)使用CAP 時(shí)增多，表明RAPA 可促進(jìn)CAP 引起的細(xì)胞自噬（見圖5）。使用Western-blot 法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3 與Beclin-1 在不同藥物處理的HCT-116 細(xì)胞中的表達(dá)?？梢钥闯雠c不使用藥物的對(duì)照組相比，單獨(dú)使用CAP 時(shí)LC3蛋白與Beclin-1蛋白的表達(dá)增加，而3-MA與CAP共同作用于HCT-116 細(xì)胞時(shí)LC3 蛋白與Beclin-1 蛋白的表達(dá)明顯降低，當(dāng)同時(shí)使用RAPA與CAP時(shí)LC3蛋白與Beclin-1 蛋白的表達(dá)相對(duì)與單獨(dú)使用CAP 時(shí)增多（見圖6）。

圖5 mCherry-GFP-LC3雙標(biāo)腺病毒檢測(cè)不同用藥組HCT-116細(xì)胞的自噬流變化

圖6 不同用藥組HCT-116細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3與Beclin-1表達(dá)量的變化

2.5 抑制和激活細(xì)胞自噬對(duì)卡培他濱引起的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用

MTT 結(jié)果顯示，HCT-116 細(xì)胞在經(jīng)CAP 處理后細(xì)胞活力明顯下降；經(jīng)CAP 與3-MA 聯(lián)合作用的HCT-116 細(xì)胞的細(xì)胞活力相較于CAP 組的HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞活力出現(xiàn)了下降；使用CAP與RAPA同時(shí)處理的HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞活力高于CAP組的HCT-116 細(xì)胞。而藥物處理的時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力也存在影響，藥物分別作用12 h、24 h、48 h、72 h 后發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間上升，細(xì)胞活力出現(xiàn)了下降，在48 h時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最低，而在72 h 時(shí)細(xì)胞活力出現(xiàn)了回升，因此藥物最佳作用時(shí)間應(yīng)為48 h（見圖7）。同時(shí)流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)法結(jié)果顯示藥物作用48 h時(shí)，不使用任何藥物的HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞存活率為94.0%，在單獨(dú)使用CAP時(shí)細(xì)胞存活率下降到50.3%，CAP聯(lián)合3-MA 使用時(shí)存活率降低到26.6%，而CAP 聯(lián)合 RAPA組細(xì)胞存活率達(dá)到86.6%（見圖8）。

圖7 MTT檢測(cè)不同用藥組HCT-116細(xì)胞在藥物處理后的HCT-116細(xì)胞存活率

圖8 流式細(xì)胞凋亡法檢測(cè)不同藥物處理后48 h的HCT-116細(xì)胞細(xì)胞凋亡情況

3 討論

細(xì)胞自噬是將細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行消化降解的過程。研究表明細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，在正常細(xì)胞中，細(xì)胞自噬利于細(xì)胞保持穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，而當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞自噬可防止有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，同時(shí)細(xì)胞自噬可抑制細(xì)胞癌變[4]。然而，在腫瘤細(xì)胞早期狀態(tài)中，自噬能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞造成損傷從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，當(dāng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入進(jìn)展期后，自噬又可抑制藥物對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，阻止藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生損傷[5]。在腫瘤化療中，自噬可以通過隔離并分解被化療藥物破壞的蛋白與細(xì)胞器，從而起到保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用，降低化療藥物的治療效果。

結(jié)腸癌作為一種高發(fā)病率的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康，而化療能夠有效地減少腫瘤的復(fù)發(fā)并延長(zhǎng)患者生命。然而化療藥物的耐藥性問題嚴(yán)重影響了結(jié)腸癌的治療效果，新化療方案的研究變得更加迫切。既往研究表明LC3與Beclin-1蛋白的表達(dá)與自噬的發(fā)生密切相關(guān)，當(dāng)自噬激活時(shí)細(xì)胞中的LC3與Beclin-1蛋白表達(dá)將升高[6]，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出3-MA可抑制HCT-116細(xì)胞的自噬，RAPA可激活HCT-116細(xì)胞的自噬。而Bax和Bcl2是與凋亡相關(guān)的蛋白，Bax蛋白表達(dá)的升高與Bcl2蛋白的降低意味著細(xì)胞凋亡增加[7]，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步判斷3-MA增強(qiáng)了卡培他濱促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡的能力，而雷帕霉素降低了卡培他濱促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡的能力。隨后使用MTT及流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)確定3-MA增強(qiáng)了卡培他濱促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡的能力，而雷帕霉素降低了卡培他濱促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡的能力。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：卡培他濱可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡的發(fā)生，同時(shí)卡培他濱引起了細(xì)胞自噬反應(yīng)的激活；通過自噬抑制劑3-MA抑制自噬反應(yīng)，細(xì)胞凋亡明顯增加，提高了卡培他濱的化療效果；而自噬激活劑雷帕霉素進(jìn)一步激活了細(xì)胞自噬反應(yīng)的發(fā)生，抑制了卡培他濱引起的細(xì)胞凋亡。這為新化療方案的研究提供了重要思路。

雷帕霉素作為mTOR抑制劑，可通過抑制mTORRaptor蛋白的表達(dá)，引起細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，但同時(shí)雷帕霉素也是一種細(xì)胞自噬激活劑，小劑量的雷帕霉素對(duì)細(xì)胞凋亡影響并不明顯，可作為細(xì)胞自噬激活劑使用[8]。有研究表明，在體外試驗(yàn)中一定劑量的雷帕霉素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有較好的殺傷效果，但在臨床實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素的表現(xiàn)并不理想，其對(duì)結(jié)腸腫瘤的殺傷效果與體外研究中的結(jié)果有很大差距，并未觀察到治療結(jié)腸癌的確切效用[9]，這可能與雷帕霉素具有細(xì)胞自噬激活效果相關(guān)，而其具體機(jī)制還有待研究。而在本研究中發(fā)現(xiàn)小劑量雷帕霉素作為自噬激活劑明顯抑制了卡培他濱的細(xì)胞毒性，降低了卡培他濱的化療效果。3-MA作為一種常見的選擇性PI3K抑制劑，可以有效地抑制PI3K通路的激活，同時(shí)3-MA也是一種有效的自噬抑制劑，有許多研究表明3-MA能夠有效地聯(lián)合其他化療藥物促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)卡培他濱作用于結(jié)腸癌細(xì)胞后細(xì)胞自噬被激活，而與3-MA共同作用后，細(xì)胞自噬被抑制，而細(xì)胞凋亡出現(xiàn)了增加?；诒狙芯空J(rèn)為，自噬的激活與抑制可影響卡培他濱的化療效果，使用自噬抑制劑聯(lián)合卡培他濱可更有效殺傷體外結(jié)腸癌細(xì)胞，更進(jìn)一步的機(jī)制及化療干預(yù)決策探索將在今后的研究中繼續(xù)進(jìn)行。