活血化濕湯治療肝癌的網絡藥理學機制

樓汪洲洋，許杰，戚璐，徐俊，程良斌

（湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢）

0 引言

活血化濕湯是河南省中醫(yī)院劉高仁、肖亞珍醫(yī)師自擬方藥，經臨床實際試用，活血化濕湯治療晚期肝癌黃疸收到良好效果，但其對肝癌本身是否也具有抗癌效果以及潛在作用機制并無相關數據，故筆者通過網絡藥理學工具對活血化濕湯治療肝癌的潛在機制進行分析探討，尋找活血化濕湯可能的治療肝癌的途徑。

中藥組方是多組分、多靶點及其組分間協(xié)同作用的復雜體系,因其主要成分復雜, 作用途徑較多, 使得中藥的深入研究極為困難, 而網絡藥理學融合了系統(tǒng)生物學和多向藥理學的思想, 被應用到生命科學的多個領域, 如新藥靶的識別、先導化合物的發(fā)現、作用機制的研究、物質基礎的篩選等, 為復雜中藥系統(tǒng)的研究提供了新的思路和視角[1]。網絡藥理學基于“藥物-靶點-疾病”相互作用網絡, 其研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點與中醫(yī)學從整體觀念、辨證論治的角度去診治疾病的理論，中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點協(xié)同作用的原理不謀而合[2]。本研究采用網絡藥理學研究方法, 對活血化濕湯主要功效物質以及配伍機制進行研究，為活血化濕湯治療肝癌作用機制的科學內涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 活血化濕湯的化學成分

本文通過查詢BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/），以Score＞20 分，P＜0.05 作為搜索條件，檢索活血化濕湯全方組成藥物黨參、茵陳、赤芍、梔子、大黃、益母草、澤蘭、紅花、茯苓、白術、赤小豆、白茅根、玉米須的所有化學成分和相應靶蛋白，去除重復化合物和蛋白，共收集203 種化合物和2012 個靶蛋白。

1.2 化合物-靶點網絡的構建

將收集的化合物與其靶點蛋白上傳至Cytoscape 3.7.1 軟件，生成一個體現藥物靶點相互作用的網絡圖, 以探究活血化濕湯的藥理學作用機制。

1.3 疾病靶點的確定

通過DisGeNET，OMIM，genecards，HPO 檢索并刪除重復項，篩出1111 個肝癌相關的靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用 (PPI) 網絡的構建和GO、KEGG 等途徑富集分析

將活血化濕湯與肝癌靶點蛋白進行映射篩選，得到302 個活血化濕湯-肝癌相關靶點蛋白，導入STRING（https://string-db.org/）進行多種蛋白質關聯(lián)分析，獲取蛋白的相互作用以及蛋白作用途徑的分類富集分析。

2 結果

2.1 活性化合物的篩選

通 過 查 詢BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），設置搜索篩選條件Score＞20 分，P＜0.05，分次輸入活血化濕湯全方組成藥物黨參、茵陳、赤芍、梔子、大黃、益母草、澤蘭、紅花、茯苓、白術、赤小豆、白茅根、玉米須進行查詢，獲取各個中藥符合Score＞20 的化學成分和相應靶蛋白，分別為黨參化學成分71 個，蛋白1260 個；茵陳化學成分19 個，蛋白910 個；赤芍化學成分9個，蛋白56 個；梔子化學成分14 個，蛋白665 個；大黃化學成分30 個，蛋白936 個；益母草化學成分9 個，蛋白690 個；澤蘭化學成分4 個，蛋白216 個；紅花化學成分22 個，蛋白525 個；茯苓化學成分18 個，蛋白525 個；白術化學成分5 個，蛋白56 個；赤小豆化學成分3 個，蛋白416 個；白茅根化學成分7 個，化學成分53個；玉米須化學成分4 個，蛋白258 個，化學成分合計215 個，運用EXCEL 合并篩選去除重復成分和蛋白，共收集203 種化學成分和2012 個靶蛋白（其中有12 個化學成分重復）。

2.2 活血化濕湯化合物-靶點網絡圖的構建

將收集整理的化合物與其靶點蛋白導入至Cytoscape 3.7.1 軟件，生成一個體現藥物-靶點相互作用的網絡圖（圖1）, 以探究活血化濕湯本身的藥理學作用機制。

圖1 活血化濕湯藥物成分與靶蛋白對應關系（左側藥物成分，右側靶蛋白，由內向外按Drgaee 大小分布，越接近圈中心，該藥物/蛋白所對應的蛋白/藥物數越多）

2.2.1 活血化濕湯藥物成分見圖2，詳細成分見表2-1。

其中對應蛋白數大于100 的化學成分，見圖3。

圖2 活血化濕湯藥物成分

圖3 活血化濕湯中對應蛋白數大于100 的化學成分

表3 -1 活血化濕湯中對應蛋白數大于100 的化學成分

表2 -1 活血化濕湯藥物成分表

續(xù)表2-1 活血化濕湯藥物成分表

2.2.2 活血化濕湯靶蛋白見圖4，主要靶蛋白見圖5，表5-1

圖4 活血化濕湯靶蛋白

圖5 主要靶蛋白（蛋白對應化學成分數大于等于20）

2.3 肝癌疾病靶點蛋白的獲得

將 Adult Hepatocellular Carcinoma、Childhood Hepatocellular Carcinoma、Early Hepatocellular Carcinoma、Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma、Hepatitis B Virus-Related Hepatocellular Carcinoma、Hepatocellular Carcinoma、Hepatoblastoma、Hepatocellular adenoma、Neoplasm of the liver 分別輸入DisGeNET，OMIM，genecards，HPO 數據庫進行檢索，其中DisGeNET 以得分大于0.01 為標準獲取蛋白153 個，Genecards以得分大于10 為標準獲取蛋白918 個，HPO 獲取蛋白86 個，OMIM 獲取蛋白105 個，將獲取的以上蛋白匯總并刪除重復項，篩出1111 個肝癌相關的靶點蛋白。

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用 (PPI) 網絡的構建和GO、KEGG 等途徑富集分析

將上述獲取的肝癌靶蛋白與活血化濕湯靶蛋白進行映射，獲得活血化濕湯-肝癌關聯(lián)靶蛋白302 個，具體蛋白如表6-1：

2.4.1 將表6-1 中302 個活血化濕湯-肝癌關聯(lián)靶蛋白上傳STRING 網站，設定為置信度＞0.9,隱藏斷開的節(jié)點，進行蛋白質-蛋白質關系分析和GO、KEGG 等途徑富集分析，獲得276 個蛋白質的蛋白質-蛋白質相互關系網絡及富集分析結果，蛋白質相互關系網絡見圖6。

表5 -1 主要靶蛋白（蛋白對應化學成分數大于等于20）

表6 -1 活血化濕湯-肝癌關聯(lián)靶蛋白

將蛋白質-蛋白質關系下載并導入Cytoscape 3.7.1 軟件，構建PPI 蛋白質關系分析網絡，運用Cytoscape 的NetworkAnalyzer功能進行分析，以Dagree（度中心性）大小為蛋白質重要性評判標準，Dagree 越大，證明該蛋白質與其他蛋白質關聯(lián)越緊密，參與治療肝癌的重要性就越大。

圖6 活血化濕湯-肝癌關聯(lián)靶蛋白STRING 蛋白質-蛋白質相互關系網絡分析

圖7 276 個蛋白質的蛋白質-蛋白質相互關系網絡圖

結合圖7 和查閱上表7-1，我們可以得知，關聯(lián)度最重要的TOP10 蛋 白 依 次 是STAT3、TP53、PIK3CA、MAPK1、PIK3R1、AKT1、EP300、MAPK3、JUN、CREBBP，意味著以上蛋白可能涉及活血化濕湯用于治療肝癌。

2.4.2 活血化濕湯-肝癌關聯(lián)蛋白的GO、KEGG 等途徑富集分析

STRING 網站有GO、KEGG 等途徑富集分析功能，對276 個蛋白的富集分析見表8。

3 總結

3.1 通過以上圖表結合實際綜合分析，活血化濕湯能用于治療肝癌的主要KEGG 途徑可能是癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路、癌癥糖蛋白、人類乳頭瘤病毒感染、MAPK 信號通路、乙型肝炎通路、癌癥小分子RNA、HTLV-I 感染途徑、肝細胞癌通路、FoxO 信號通路、Ras 信號通路、HIF-1 信號通路等途徑。

3.2 其涉及的生物過程主要與細胞過程、生物調節(jié)、刺激反應、代謝過程、有機物質代謝過程、生物過程調節(jié)、細胞代謝過程、細胞過程調節(jié)、初級代謝過程、化學反應、細胞對刺激的反應、氮化合物代謝過程、多細胞組織過程、生物過程的正規(guī)律、代謝過程調節(jié)、細胞過程的正調節(jié)、發(fā)展過程、細胞代謝過程調節(jié)、原發(fā)性代謝過程調節(jié)等過程密切相關。

表7 -1 276 個蛋白質的蛋白質-蛋白質關系大小

續(xù)表7-1 276 個蛋白質的蛋白質-蛋白質關系大小

表8 關聯(lián)蛋白KEGG 途徑（TOP50）

表9 關聯(lián)蛋白生物過程（TOP50）

表10 關聯(lián)蛋白分子功能(TOP50)

表11 核心蛋白結構域分析

3.3 對分子功能的影響主要在蛋白質結合、離子結合、有機循環(huán)復合結合、催化活性、雜環(huán)復合結合、酶結合、陽離子結合、金屬離子結合、信號受體結合相同蛋白結合、陰離子結合、小分子結合、藥物結合、分子調節(jié)、核苷酸結合、蛋白質二聚作用、碳水化合物衍生物、轉移酶活性、核酸結合、作用于DNA 結合蛋白質、核糖核苷酸結合催化活性，轉錄調節(jié)器活動、嘌呤核苷酸結合、嘌呤核糖核酸、嘌呤核糖核酸、腺酰核苷酸結合、腺基核糖核苷酸結合、ATP 結合、含蛋白質的復雜裝訂、蛋白質均聚化活動、轉錄因子結合、分子換能器活動、過渡金屬離子結合等方面。

3.4 作用的主要核心蛋白域家族：蛋白激酶域、核激素受體類域超家族、酪氨酸蛋白激酶催化域、Serine / threon 蛋白激酶、細胞色素P450 超家族、AAA + atp 酶域、agc -激酶、BLC2 家族、TGF-β 蛋白、ABC 跨膜轉運蛋白超家族等。

4 討論

活血化濕湯全方充分體現了大積大聚，必須大破方能大立，其對傷肝久積成疾之巨塊型肝癌以攻為主，寓補于攻的思想。積無除，病不解，不搜而逐之，日進補湯無益也。也應注意攻邪而不傷正，養(yǎng)正而不助邪[3]。

通過網絡藥理學方法分析，活血化濕湯其治療肝癌的潛在通路除了癌癥通路外，首當其沖的就是PI3K-Akt 信號通路。目前醫(yī)學界通過對肝癌患者癌組織以及肝癌細胞株內存在多條信號通路過度活化的研究中，我們可以發(fā)現PI3 K/Akt 信號通路是細胞內外信號轉導一個重要紐帶，在細胞抗凋亡、增殖、分化以及侵襲轉移中起到至關重要作用[4]。另外MAPK 信號通路抑制肝癌細胞增殖、侵襲和遷移[5]， PI3K/AKT/FOXO4 信號軸影響HCC 的增殖能力與凋亡能力,在HCC 的發(fā)病和進展中起著非常重要的作用，[6]影響Ras 信號通路激活Myc 表達調節(jié)細胞核內周期進程[7]。對HIF-1 信號通路可通過抑制HIF-1α 影響癌細胞的能量代謝,進而達到抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的目的[8-10]。

本研究通過網絡藥理學技術層面，基于中藥藥理學BATMAN數據庫平臺的活血化濕湯有效成分及體內預測靶標理論化揭示了活血化濕湯對肝癌的作用機制，為活血化濕湯及相關藥物的新藥研發(fā)和機制研究奠定基礎。