TGF-β1調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲能力的機制研究

鈔敏，劉楠，婁淼，劉競輝，翟玉龍，王樑，涂艷陽

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 a.神經(jīng)外科，b.實驗外科，西安 710038)

惡性腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的50%～60%[1]。此外，由于膠質(zhì)瘤惡性程度較高，呈浸潤性生長，與正常腦組織分界不清，導(dǎo)致手術(shù)難以全部切除，因此，臨床上常采用術(shù)后放療聯(lián)合替莫唑胺或丙卡巴嗪、洛莫司汀及長春新堿方案化療[2]。盡管手術(shù)治療、程序性細胞死亡受體1靶向治療和免疫治療等手段逐步發(fā)展，但惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍較差[3-4]，低級別膠質(zhì)瘤患者的中位生存期只有7年[5-6]，而高級別膠質(zhì)瘤患者的2年生存率只有25%[7]。世界衛(wèi)生組織2016年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類方案首次將異檸檬酸脫氫酶突變和其他基因及染色體改變納入分類標(biāo)準，在組織學(xué)分類的基礎(chǔ)上將膠質(zhì)瘤再次分為異檸檬酸脫氫酶突變型(約10%)和異檸檬酸脫氫酶野生型(約90%)[8-9]。然而，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展受到多種基因組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，因此，研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的治療靶點，是膠質(zhì)瘤臨床治療過程中亟待解決的難題。

研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨細胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可以穩(wěn)定Sox9蛋白的表達，且Sox9過表達會上調(diào)TGF-β1的作用靶標(biāo)3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸合成酶2 mRNA的表達[10-11]。在食管腺癌細胞和成纖維細胞中，TGF-β的配體β2SP(β-spectrin)丟失會激活Notch通路和Sox9表達，并增強Notch和Sox9的核定位[12]。因此，推測在膠質(zhì)瘤細胞中TGF-β1與Sox9存在上述調(diào)控關(guān)系。本研究主要探索TGF-β1調(diào)控膠質(zhì)瘤遷移和侵襲能力的機制，為膠質(zhì)瘤的臨床治療和科學(xué)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及材料 U251膠質(zhì)瘤細胞、U373膠質(zhì)瘤細胞及BV2小膠質(zhì)細胞均購自中國科學(xué)院上海生科院細胞庫，改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modification of Eagle′s medium dulbecco,DMEM)(美國Hyclone公司，批號：SH30243.01B)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)(美國Hyclone公司,批號：SH30256.01B)、胰酶(美國Sigma公司，批號：9002-07-7)、TGF-β1(上海近岸科技有限公司，批號：CA59)、Sox9抗體(美國Abcam公司，批號：ab185230)、β-actin抗體(武漢Abclonal生物科技有限公司，批號：AC026)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(武漢Abclonal生物科技有限公司，批號：AS014)、青-鏈霉素雙抗(美國Hyclone公司，批號：SV30010)、胎牛血清(德國Gemini公司，批號：A49F74G)、蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：0330181805)、Matrigel基質(zhì)膠(美國Coring公司，批號：8071270)、聚偏二氟乙烯膜(美國Millpore公司，批號：IPVH00010)、超敏化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒(西安晶彩生物公司，批號：JC-PC001)、Transwell小室(美國Corning公司，批號：3402)。

1.1.2主要儀器 Western Blot實驗裝置(美國Bio-Rad公司，型號：1645050)、紫外發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad公司，型號：ChemiDoc XRS+)、低溫離心機(德國Eppendorf公司，型號：5804R)、紫外分光光度儀(美國Bio-Rad公司，型號：1681135)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，型號：GX71)、恒溫細胞孵育箱(美國Thermo公司，型號：3308)、細胞培養(yǎng)工作臺(江蘇太倉實驗儀器廠)。

1.2方法

1.2.1Western Blot檢測膠質(zhì)瘤細胞中Sox9的表達 取U251膠質(zhì)瘤細胞和BV2小膠質(zhì)細胞各一皿，用細胞刮刀將細胞收集在1.5 mL離心管內(nèi)，加入100 μL預(yù)冷的蛋白裂解液，在冰上裂解30 min；4 ℃，以離心半徑8 cm,12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管中，聚氰基丙烯酸正丁酯法蛋白定量后，按比例加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性；按照每孔10 μg的總蛋白量進行變性蛋白電泳100 V 2 h；濕轉(zhuǎn)法250 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h；用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h；經(jīng)Sox9抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶150 000)4 ℃孵育過夜；TBST(Tris鹽酸緩沖鹽溶液+Tween)溶液洗滌3次，每次10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；暗室內(nèi)在PVDF膜上滴加超敏化學(xué)發(fā)光底物進行化學(xué)發(fā)光，以上實驗重復(fù)3次。

1.2.2TGF-β1處理U251和U373膠質(zhì)瘤細胞 將生長匯合至80%的U251和U373膠質(zhì)瘤細胞分別傳代至12個6 cm皿內(nèi)，分為處理組和未處理組，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，各取 6皿處理組U251和U373膠質(zhì)瘤細胞加入TGF-β1，終濃度為5 μg/L，未處理組不予任何處理，作為對照，記錄時間，用細胞刮刀分別收取20 min、40 min、1 h、2 h、4 h及6 h的處理組及未處理組細胞于1.5 mL離心管內(nèi)；加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃，以離心半徑8 cm,12 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管內(nèi)，聚氰基丙烯酸正丁酯法蛋白定量后，按比例加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性后行Western blot實驗，實驗重復(fù)3次。

1.2.3劃痕愈合實驗 取處于對數(shù)生長期的U373和U251膠質(zhì)瘤細胞接種于6孔板中，分為處理組和未處理組，調(diào)整細胞密度為5×105/mL，鋪板生長24 h后，處理組用TGF-β1分別處理U251膠質(zhì)瘤細胞2 h和U373膠質(zhì)瘤細胞20 min，終濃度為5 μg/L，未處理組不予任何處理，作為對照，平行于6孔板長邊用記號筆在背面劃線，用無菌的200 μL槍頭沿著直尺在6孔板內(nèi)垂直畫3條平行的劃痕，PBS洗去殘余漂浮細胞，更換為無血清培養(yǎng)基后，在倒置顯微鏡下標(biāo)記并拍照記錄，之后在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，分別鏡下拍照記錄同一視野24 h及48 h的膠質(zhì)瘤細胞的遷移距離。

1.2.4Transwell遷移實驗 取處于對數(shù)生長期的U373和U251膠質(zhì)瘤細胞，分為處理組和未處理組，處理組用TGF-β1分別處理U251膠質(zhì)瘤細胞2 h和U373膠質(zhì)瘤細胞20 min，未處理組不予任何處理，作為對照，胰酶消化并用無血清的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，以200 μL/孔將細胞懸液加入 Transwell小室上室，每個下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室上室，用棉簽拭去小室上層的細胞，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗去小室上層殘余培養(yǎng)基及脫落細胞，用100%甲醇溶液室溫固定20 min，PBS沖洗2次，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫的染色10 min，PBS洗去未結(jié)合的染液，將Transwell小室上室放入干凈24孔板中，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張膜隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)小室底膜下室面的細胞數(shù)。

1.2.5Transwell侵襲實驗 Matrigel基質(zhì)膠1∶8稀釋后包被Transwell小室上室，放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中4 h，取處于對數(shù)生長期的U373和U251膠質(zhì)瘤細胞，分為處理組和未處理組，處理組用TGF-β1分別處理U251膠質(zhì)瘤細胞2 h和U373膠質(zhì)瘤細胞20 min后，胰酶消化并用無血清的DMEM重懸，調(diào)整細胞濃度為1×104/mL，以200 μL/孔將細胞懸液加入包被好的Transwell小室上室，剩余步驟同標(biāo)題1.2.4。

2 結(jié) 果

2.1Sox9在膠質(zhì)瘤細胞中的表達 Western blot結(jié)果顯示，U251膠質(zhì)瘤細胞的Sox9蛋白表達水平高于 BV2小膠質(zhì)細胞(1.816±0.143比0.282±0.014)(t=10.670，P<0.001)，見圖1。

圖1 BV2小膠質(zhì)細胞與U251膠質(zhì)瘤細胞中Sox9的表達水平

2.2TGF-β1處理U251和U373膠質(zhì)瘤細胞后的Sox9蛋白表達水平 TGF-β1分別處理U251細胞2 h 及U373細胞20 min后Sox9的蛋白表達水平高于未處理組(P<0.05)，其他時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、表2、圖2、圖3。

組別20 min40 min1 h2 h4 h6 h未處理組2.198±0.511.712±0.3821.827±0.397 1.347±0.0242.239±0.656 1.816±0.285TGF-β1處理組1.909±0.341.586±0.096 1.731±0.2271.570±0.0611.616±0.0722.111±0.162t值0.4690.3200.2113.4390.9450.899 P值0.663 0.765 0.844 0.026 0.398 0.419

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1

組別20 min40 min1 h2 h4 h6 h未處理組1.490±0.0361.882±0.573 1.713±0.211 1.821±0.3901.898±0.3112.136±0.430TGF-β1處理組2.125±0.1882.045±0.5291.234±0.2152.030±0.6102.562±0.801.627±0.178t值3.3180.2081.5920.2880.7731.095P值0.0290.8450.1870.7880.4820.335

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；+：TGF-β1處理組；-：未處理組

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；+：TGF-β1處理組；-：未處理組

2.3TGF-β1分別處理U251和U373膠質(zhì)瘤細胞后遷移能力 劃痕愈合實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞的遷移距離結(jié)果顯示，TGF-β1處理2 h后的U251膠質(zhì)瘤細胞24 h和48 h的遷移距離大于未處理組，TGF-β1處理20 min后的U373膠質(zhì)瘤細胞24 h和48 h遷移距離大于未處理組，見圖4。

2.4TGF-β1分別處理U251和U373膠質(zhì)瘤細胞后的侵襲能力 Transwell實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力結(jié)果顯示：處理組的U251和U373膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力均大于未處理組(188.2±10.5比142.8±5.6，102.7±0.9比77.0±1.7)(t=3.836,P=0.005；t=13.990,P<0.001)；處理組的U251和U373膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力均較未處理組增強(117.9±2.6比74.7±4.2,123.3±6.0比69.6±2.5)(t=8.845,P<0.001；t=8.254,P<0.001)，見圖5。

3 討 論

TGF-β信號通路是一條極為重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。哺乳動物的TGF-β有TGF-β1、TGF-β2和 TGF-β33種亞型，激活的TGF-β細胞因子通過與細胞膜上Ⅰ型和Ⅱ型的TGF-β跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，形成異源復(fù)合物從而啟動細胞內(nèi)反應(yīng)[13-14]。大量的體內(nèi)體外實驗表明，TGF-β能夠通過影響腫瘤微環(huán)境、增強侵襲性質(zhì)和抑制免疫細胞功能來促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，并且調(diào)控多種不同的細胞生物學(xué)效應(yīng)，其中包括細胞的增殖、分化、遷移和黏附、凋亡等[15-16]。

TGF-β通路與Sox9均參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，有研究表明Sox9可能是TGF-β調(diào)控部分腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要下游靶點[17]。Sox9作為干性轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號通路的重要節(jié)點[18-21]，參與調(diào)控乳腺癌[22]、肝癌[23]、肺癌[20,24]、膠質(zhì)瘤[25]等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。Hiraoka等[17]證實了Sox9對富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生過程中起重要作用。de Bont等[26]通過微陣列分析技術(shù)表明Sox9在兒童室管膜瘤中高表達。Gao等[27]提出Sox9在腦膠質(zhì)瘤中高表達，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；con：未處理組；TGF-β1+：TGF-β1處理組

TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；con：未處理組；TGF-β1+：TGF-β1處理組

Sabelstr?m等[28]研究發(fā)現(xiàn)miR-124可以通過直接靶向作用于Sox9抑制膠質(zhì)瘤的侵襲，并且可以增加其放療敏感性。研究表明，Sox9在膠質(zhì)瘤組織中高表達，其在膠質(zhì)瘤的增殖、遷移和侵襲，以及膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新中扮演重要角色，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[29-30]，但是其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的具體機制尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，與小膠質(zhì)細胞相比，膠質(zhì)瘤細胞中Sox9表達升高。有研究表明，Sox9表達下調(diào)后，膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲能力均降低，說明Sox9與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[31]。

Chavez等[11]和Song等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨細胞、食管腺癌細胞和成纖維細胞中，TGF-β可以通過穩(wěn)定Sox9的蛋白水平調(diào)控其下游分子的表達。為了驗證在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β與Sox9是否存在上述類似的調(diào)控關(guān)系，本研究采用TGF-β1細胞因子處理膠質(zhì)瘤細胞，觀察Sox9蛋白水平的表達情況，這是因為在體內(nèi)TGF-β通路的主要作用因子是TGF-β1。本研究結(jié)果顯示，在U251及U373膠質(zhì)瘤細胞中，TGF-β1均可以穩(wěn)定Sox9蛋白表達，但兩個細胞系Sox9表達峰值出現(xiàn)的時間點有差別，這可能是由于不同的細胞系對TGF-β1的敏感性不同導(dǎo)致的。本研究細胞功能實驗結(jié)果顯示，與未處理組相比，TGF-β1處理組的細胞遷移和侵襲能力均增強。其原因可能是TGF-β1通過穩(wěn)定Sox9蛋白的表達調(diào)控膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲能力，具體的機制有待下一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀以及挽救實驗等來探索。

綜上所述，本研究初步證實了在膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)TGF-β1通過穩(wěn)定Sox9蛋白表達促進膠質(zhì)瘤細胞的遷移及侵襲能力，下一步將構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系通過挽救實驗等進一步驗證TGF-β1與Sox9在膠質(zhì)瘤內(nèi)的調(diào)控關(guān)系，同時提出猜想：在膠質(zhì)瘤細胞中，TGF-β1是否通過經(jīng)典的Smad蛋白來調(diào)控Sox9轉(zhuǎn)錄因子的表達，進一步對TGF-β通路通過穩(wěn)定Sox9蛋白表達調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制進行探索，尋找膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中新的機制和治療靶點，為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的思路和方向。