手性柱液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定人體尿液中泮托拉唑?qū)τ丑w濃度*

張學(xué)會(huì)，柏 蓉，費(fèi) 姚，趙 萍，鮑麗琴

南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院 藥學(xué)部，蘇州 215228

泮托拉唑是一種質(zhì)子泵抑制劑，主要用于胃潰瘍、十二指腸潰瘍、反流性食管炎、卓-艾綜合征（胃泌素瘤）等[1]消化性疾病的治療。其結(jié)構(gòu)中含有一手性中心硫原子，存在（S）-和（R）-型對(duì)映異構(gòu)體，左旋泮托拉唑具有比泮托拉唑更高的療效[2]。為了研究左旋泮托拉唑在人體的尿藥排泄特征，有必要建立一種簡(jiǎn)單而具有選擇性的檢測(cè)方法，測(cè)定人尿液中泮托拉唑?qū)τ钞悩?gòu)體的含量。

國(guó)內(nèi)外對(duì)泮托拉唑?qū)τ钞悩?gòu)體的測(cè)定方法有高效液相色譜法、超高效液相色譜法（UPLC）、液質(zhì)聯(lián)用法等[3，4]。已報(bào)道的測(cè)定泮托拉唑?qū)τ钞悩?gòu)體的手性HPLC-UV法，存在分析時(shí)間較長(zhǎng)、靈敏度較低和樣本前處理復(fù)雜等問(wèn)題[5]。已報(bào)道[6]的測(cè)定泮托拉唑鈉對(duì)映異構(gòu)體的手性HPLC法，雖然手性柱的立體選擇性強(qiáng)，但是結(jié)構(gòu)選擇性卻很差，生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)通常會(huì)干擾目標(biāo)物的測(cè)定，液相檢測(cè)分析時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，且生物樣品前處理較復(fù)雜。本文建立了手性柱-液質(zhì)聯(lián)用法（Chiral-LCMS）同時(shí)測(cè)定人體尿液中左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑的藥物濃度，該方法具有分析時(shí)間短、高靈敏度和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

對(duì)照品為左旋泮托拉唑鈉（手性HPLC純度99.6%，批號(hào)：20150301）、右旋泮托拉唑（手性HPLC純度：99.6%，批號(hào)：1653-022A4）和內(nèi)標(biāo)（R）-Pantoprazoled6（手性HPLC純度：99.3%，批號(hào)：1653-018A3），均由TLC Pharmachem Inc.提供。

乙腈、乙酸（色譜純）；甲酸、乙酸銨、氨水（分析純）；去離子純化水通過(guò)Millipore純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀：1290 Infinity高效液相色譜儀，包括：柱溫箱（G1316C）、多孔板自動(dòng)進(jìn)樣器（G4226A）和二元高壓泵（G4220A），安捷倫科技有限公司；API 4000，美國(guó)應(yīng)用生物公司；色譜工作站：Analyst?軟件：1.6.2版本，美國(guó)應(yīng)用生物公司；BP 211D型電子天平，Sartorius公司；AL-204型分析天平，Mettler Toledo公司；STRATOS高速冷凍離心機(jī)，Thermo公司。

2 方 法

2.1 檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱：ChiralPAK IE（4.6mm×150mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：乙腈∶10 mmol·L-1乙酸銨（含0.1%乙酸）=72∶28（v/v）；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：1.0 μL；分析時(shí)間：10 min。

質(zhì)譜條件：離子檢測(cè)方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化方式為電噴霧離子化（ESI）；離子極性為正離子；離子化電壓（IS）為5500V；溫度為600℃；霧化氣（Gas 1）為379 kPa；渦輪氣（Gas 2）為79 kPa；氣簾氣（Curtain Gas）為276 kPa；碰撞氣（Collision Gas）為69 kPa。檢測(cè)離子對(duì)：左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑均為m/z 384.1→200.1；內(nèi)標(biāo)為390.1→206.0。

2.2 溶液的配制

左旋泮托拉唑溶液的配制：精密稱取左旋泮托拉唑鈉10.62 mg，用乙腈溶解并稀釋配制成濃度約為1.000mg·mL-1的儲(chǔ)備液；用乙腈稀釋儲(chǔ)備液，制成不同濃度的左旋泮托拉唑溶液，于-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

右旋泮托拉唑溶液的配制：精密稱取右旋泮托拉唑鈉10.04 mg，用乙腈溶解并稀釋配制成濃度約為1.000 mg·mL-1的儲(chǔ)備液；用乙腈稀釋儲(chǔ)備液，制成不同濃度的右旋泮托拉唑溶液，于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)（（R）-Pantoprazole-d6）溶液的配制：用乙腈將對(duì)照物瓶中的1 mg內(nèi)標(biāo)充分溶解（經(jīng)純度校正相當(dāng)于內(nèi)標(biāo)0.993 mg），配制成濃度為99.3 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液；用乙腈稀釋儲(chǔ)備液，制成99.3 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 尿液樣本的前處理

取1.5mL塑料離心管數(shù)支，加入100μL尿液樣本和5μL乙腈，渦旋10 s，混勻，再加入200 μL含內(nèi)標(biāo)99.3ng·mL-1的乙腈，渦旋10 min，于4 ℃、16 000 r·min-1離心15min。取上清液50μL于另一1.5mL塑料離心管中，加入0.1%氨水150 μL，渦旋混勻，取上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，進(jìn)行Chiral-LC-MS分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本及質(zhì)控樣本的配制和處理

取1.5 mL塑料離心管數(shù)支，分別加入空白尿液100 μL，再加入5 μL相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線用工作液或質(zhì)控用工作液，渦旋10 s，混勻，制成含左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑濃度分別為2.50、5.00、15.00、50.0、150、500、1500、2500、4500、5000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液樣本，以及左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑濃度分別為6.00、200、4000 ng·mL-1的質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液樣本。于上述制備好的各標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液樣本中，加入200 μL含內(nèi)標(biāo)99.3 ng·mL-1的乙腈，以下操作同“2.3”項(xiàng)。

2.5 測(cè)定

研究2名健康受試者靜脈輸注20 mg注射用左旋泮托拉唑鈉后的尿藥排泄預(yù)特征。經(jīng)檢查合格的2名健康受試者在試驗(yàn)日前入?、衿谂R床試驗(yàn)病房，晚上進(jìn)統(tǒng)一清淡飲食，然后禁食10 h，不禁水過(guò)夜。早上恒速泵單次靜脈輸注給藥20 mg（60 min內(nèi)滴完）。于給藥前（0 h）及靜脈開(kāi)始輸注后收集血漿樣品，同時(shí)收集給藥0 h及開(kāi)始給藥后0～3 h、3～6 h、6～12 h、12～24 h各時(shí)間段的所有尿液。

3 結(jié)果

3.1 特異性考察

按“2.1檢測(cè)條件”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，左旋泮托拉唑、右旋泮托拉唑和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為7.5 min、6.0 min和5.9 min，典型的色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，左旋泮托拉唑、右旋泮托拉唑和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取“2.4”項(xiàng)下的左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑，濃度均為2.50、5.00、15.0、50.0、150、500、1500、2500、4500、5000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)樣本，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑各自峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面積比值f對(duì)血藥濃度C作權(quán)重回歸計(jì)算，根據(jù)最小二乘法得出直線回歸方程并作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（f=a×C+b），權(quán)重系數(shù)為1/C2。計(jì)算各樣本實(shí)測(cè)濃度及準(zhǔn)確度（Accuracy，%），DB（空白樣品，不含分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)）、BK（零濃度樣品，只含內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)）不參與標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析。結(jié)果顯示，左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑的線性范圍均為2.50～5000 ng·mL-1，線性關(guān)系良好。典型的回歸方程為：

左旋泮托拉唑：f=4.62×10-3C+7.75，r=0.9973，w=1/C2

右旋泮托拉唑：f=4.35×10-3C+0.00125，r=0.9958，w=1/C2

該方法的左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑的定量下限均為2.50 ng·mL-1，且信噪比均大于10。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下方法制備含左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑濃度均為2.50、6.00、200、4000 ng·mL-1的樣本，每個(gè)濃度各配制5份，共測(cè)定3個(gè)分析批。按“2.3”項(xiàng)下方法處理。左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果見(jiàn)表1。表明高、中、低及定量下限4種濃度的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度均小于15%，符合生物樣本分析測(cè)試的要求。

3.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

表1 Chiral-LC-MS法測(cè)定人尿液中左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑的批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度和精密度（n=5）

3.4.1 基質(zhì)效應(yīng) 配制空白尿液樣本，按配制低、高2種濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液的量，分別加入對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，稀釋后進(jìn)行LC-MS/MS分析，以67%的乙腈水代替的同法處理樣本進(jìn)樣峰面積，比較尿液樣本中左旋泮托拉唑、右旋泮托拉唑及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)。濃度為12.0、8000 ng·mL-1的左旋泮托拉唑的基質(zhì)效應(yīng)分別是（110.7±3.2）%和（104.4±2.4）%；濃度為12.0、8000 ng·mL-1的右旋泮托拉唑的基質(zhì)效應(yīng)分別是（108.9±2.9）%和（105.2±2.4）%；濃度為100 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)是（106.0±2.8）%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尿液樣本中左旋泮托拉唑、右旋泮托拉唑及內(nèi)標(biāo)均無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。

3.4.2 提取回收率 按“2.4”項(xiàng)下方法，分別制備含低、中、高3種濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液；同時(shí)配制空白尿液樣本，按配制低、中、高3種濃度標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液的量，分別加入對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，稀釋后進(jìn)行LC-MS/MS分析，分別計(jì)算低、中、高3種濃度的提取回收率。濃度為12.0、400、8000 ng·mL-1的左旋泮托拉唑的提取回收率分別是（92.4±5.4）%、（96.2±4.2）%和（91.6±1.9）%；濃度為12.0、400、8000 ng·mL-1的右旋泮托拉唑的提取回收率分別是（94.0±1.9）%、（95.9±3.9）%和（90.5±2.5）%；濃度為100.00 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)的提取回收率是（97.4±4.6）%。泮托拉唑?qū)τ钞悩?gòu)體的提取回收率良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別考察在不同實(shí)驗(yàn)條件下，左旋泮托拉唑（無(wú)右旋泮托拉唑）、右旋泮托拉唑（無(wú)左旋泮托拉唑）以及左旋泮托拉唑-右旋泮托拉唑（含量比為1∶1）在尿液及待測(cè)樣品溶液中左旋泮托拉唑和/或右旋泮托拉唑的穩(wěn)定性。按“2.4”項(xiàng)下方法配制含左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑濃度均為6.00、200、4000 ng·mL-1的混合樣本，同時(shí)配制僅含左旋泮托拉唑或僅含右旋泮托拉唑的濃度分別為6.00、200、4000 ng·mL-1的樣本，每種濃度配制數(shù)份。按“2.3”項(xiàng)下方法處理上述泮托拉唑?qū)τ钞悩?gòu)體的樣本，于4 ℃進(jìn)樣器中放置24 h；于室溫24 ℃放置8 h；于-70 ℃反復(fù)凍融3次；于-70 ℃冰箱中冷凍保存30天、待測(cè)前取出化凍后等，作穩(wěn)定性參考。結(jié)果表明，左旋泮托拉唑及右旋泮托拉唑尿液樣本在上述不同實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性均良好；符合生物樣本分析測(cè)試的要求。

3.6 殘留效應(yīng)

按“2.4”項(xiàng)下方法配制并處理1份含左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑濃度均為10 000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液樣本，同時(shí)按“2.3”項(xiàng)下方法處理5份空白尿液樣本，將標(biāo)準(zhǔn)含藥尿液樣本和空白尿液樣本交替進(jìn)樣，進(jìn)行Chiral-LC-MS分析。結(jié)果表明，左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)進(jìn)樣分析后，無(wú)殘留，不影響后續(xù)樣本的測(cè)定。

3.7 應(yīng)用結(jié)果

2例受試者單次靜脈輸注注射用左旋泮托拉唑鈉后，尿液樣本中該品濃度小于25 ng·mL-1，左旋泮托拉唑在尿液中未發(fā)生手性轉(zhuǎn)化，未測(cè)得右旋泮托拉唑，經(jīng)計(jì)算受試者的累積尿排泄率均小于0.03%。

4 討論

在試驗(yàn)方法建立前，對(duì)色譜柱類型、流動(dòng)相比例、內(nèi)標(biāo)濃度及離子對(duì)的選擇等條件進(jìn)行了摸索，而后選擇了最佳的分析方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。建立了同時(shí)測(cè)定人尿液中左旋泮托拉唑和右旋泮托拉唑濃度的Chiral-LC-MS法，尿液中雜質(zhì)不干擾樣品的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為2.50～5000 ng·mL-1，線性關(guān)系均良好；高、中、低3種濃度的質(zhì)控樣本準(zhǔn)確度在±15%；樣品和內(nèi)標(biāo)均無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。在泮托拉唑?qū)τ丑w的儲(chǔ)存、處理和分析過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)兩者間的手性轉(zhuǎn)化，測(cè)定過(guò)程中各化合物穩(wěn)定性符合要求。試驗(yàn)證明，采用本法測(cè)定人體尿液中藥物濃度，定量準(zhǔn)確、精密度高、穩(wěn)定性好，易于操作，可用于泮托拉唑鈉左旋體與右旋體的立體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)研究，具有一定的實(shí)用性。