原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中CYP2J2和EETs的表達(dá)及臨床意義

徐 強(qiáng)，宋 蒨，周 瑜，徐元豐，巢浩強(qiáng)， 石紅建

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球較為常見且惡性度較高的腫瘤，其病死率僅次于肺癌和胃癌，位居第3位，發(fā)病率居第5位[1-2]。由于HCC早期無明顯癥狀，且較早即發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，確診時(shí)大多已是中晚期，治療效果較差，嚴(yán)重影響患者的生存期[3-5]。環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)是機(jī)體花生四烯酸的代謝產(chǎn)物，在促進(jìn)組織再生和血管生成方面發(fā)揮重要作用，有研究顯示EETs可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤血管的生成[6]。細(xì)胞色素P450表氧化酶2J2(cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase 2J2, CYP2J2)屬于P450同工酶家族，是EETs的新型代謝途徑，具有調(diào)節(jié)血管活性和細(xì)胞增殖等功能[7]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，EETs、CYP2J2與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但在肝癌中的作用未見相關(guān)報(bào)道[5-7]。本實(shí)驗(yàn)將探討HCC中EETs、CYP2J2的表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征、預(yù)后的相關(guān)性，旨在為肝癌患者的診療及評估預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1月～2016年12月江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的86例HCC石蠟包埋組織為研究對象。收集患者的臨床病理資料?；颊吣挲g34～65(48.31±8.21)歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床信息完整；(2)均接受根治性HCC切除術(shù)，經(jīng)病理確診為HCC；(3)均為初使治療，術(shù)前均未行放、化療；(4)診斷及分期符合美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第7版標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 采用免疫組化SP法檢測HCC組織中EETs、CYP2J2的表達(dá)。具體步驟：將標(biāo)本用10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，放入恒溫烤箱烤片。常規(guī)脫蠟脫水，PBS沖洗，檸檬酸高壓修復(fù)，滴加對應(yīng)一抗EETs(美國CST公司)、CYP2J2(美國Santa Cruz Biotechnol公司)，4 ℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加對應(yīng)二抗，PBS沖洗，滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。

1.3 結(jié)果判定 EETs、CYP2J2蛋白均為細(xì)胞核表達(dá)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)按陽性細(xì)胞所占的比例評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；(2)按細(xì)胞染色程度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：≥2分為高表達(dá)，<2分為低表達(dá)。

1.4 隨訪 患者每3個(gè)月隨訪1次，記錄患者生存時(shí)間等。隨訪截至2018年12月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)。單因素及多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。應(yīng)用Spearman分析CYP2J2和EETs表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織中CYP2J2和EETs的表達(dá) 86例HCC組織中36例CYP2J2高表達(dá)，高表達(dá)率為41.86%(36/86)，低表達(dá)率為58.14%(50/86)；45例EETs高表達(dá)，高表達(dá)率為52.33%(45/86)，低表達(dá)率為47.67%(41/86)(圖1)。

ABCD

圖1 A.肝細(xì)胞癌中CYP2J2蛋白高表達(dá)；B.肝細(xì)胞癌中CYP2J2蛋白低表達(dá)；C.肝細(xì)胞癌中EETs蛋白高表達(dá)；D.肝細(xì)胞癌中EETs蛋白低表達(dá)，SP法

2.2 CYP2J2和EETs表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系 CYP2J2和EETs不同表達(dá)狀態(tài)的患者在TNM分期、分化程度、有無靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；CYP2J2和EETs高表達(dá)組患者更多見于Ⅲ+Ⅳ期、中+低分化、合并靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(表1)。

2.3 CYP2J2和EETs表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系 CYP2J2低表達(dá)組患者的2年生存率為52.00%(26/50)，高于CYP2J2高表達(dá)組(30.56%，11/36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.282，P=0.002)；EETs低表達(dá)組患者的2年生存率為58.54%(24/41)，高于EETs高表達(dá)組(26.67%，12/45)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.969，P=0.009，圖2、3)。

2.4 Cox單因素和多因素分析 單因素分析結(jié)果顯示：CYP2J2、EETs、腫瘤分化程度、分期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和合并靜脈癌栓與肝癌患者預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)。多因素分析結(jié)果顯示：CYP2J2、EETs為影響肝癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05，表2、3)。

2.5 HCC組織中CYP2J2和EETs表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CYP2J2和EETs蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.810，P<0.001，表4)。

3 討論

HCC是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，其發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢，發(fā)病率位居我國癌癥發(fā)病率的第5位，2018年全球約有78萬例新發(fā)肝癌患者，半數(shù)以上發(fā)生于我國[8]。以肝癌切除術(shù)為主，以化療、放療和靶向治療為輔的綜合治療，大大改善了肝癌患者的預(yù)后，但即使行根治性切除術(shù)，HCC術(shù)后復(fù)發(fā)率仍較高[9]。因此，尋找可靠的標(biāo)志物和行之有效的干預(yù)靶點(diǎn)，有助于肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療，進(jìn)而改善肝癌患者預(yù)后和提高存活率。EETs是花生四烯酸經(jīng)細(xì)胞色素P450代謝生成，在調(diào)節(jié)炎癥、促進(jìn)血管生成等過程中發(fā)揮重要作用，另可通過下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)防止腫瘤細(xì)胞凋亡，能明顯促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲。CYP2J2是P450同工酶家族的一員，廣泛分布于肝臟、肺臟等內(nèi)臟器官以及血管內(nèi)皮細(xì)胞中，參與體內(nèi)多種生理、病理過程，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在食管癌、肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

相關(guān)研究[10-11]顯示，EETs及CYP2J2與多種腫瘤的臨床病理學(xué)特征具有明顯的相關(guān)性。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EETs及CYP2J2與HCC患者臨床病理特征顯著相關(guān)。CYP2J2和EETs不同表達(dá)狀態(tài)的患者在TNM分期、分化程度、有無靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；CYP2J2和EETs高表達(dá)患者更多見于Ⅲ+Ⅳ期、中+低分化、合并靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。EETs及CYP2J2高表達(dá)患者更多見于腫瘤分期較晚、分化程度更低、且更易合并靜脈癌栓和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，均是影響HCC患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素。EETs及CYP2J2的表達(dá)狀態(tài)與HCC病灶的直徑無明顯相關(guān)性，提示HCC大小可能更多與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的時(shí)間有關(guān)。相關(guān)研究[12]表明，CYP2J2的表達(dá)狀態(tài)與腫瘤患者的生存時(shí)間明顯相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CYP2J2低表達(dá)患者的生存期比CYP2J2高表達(dá)患者的生存期更長。Jiang等[13]的研究結(jié)果顯示，過表達(dá)CYP2J2可通過影響腫瘤直徑和腫瘤的生長速度影響腫瘤患者的預(yù)后，且經(jīng)CYP2J2代謝衍生的EETs可通過影響tetraspanin、MMP和E-cadherin等黏附分子的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移。另一項(xiàng)納入了101例腫瘤患者的研究[14]顯示，77%的腫瘤患者中CYP2J2呈高表達(dá)，CYP2J2高表達(dá)的患者預(yù)后較差。

表1 CYP2J2和EETs蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

圖2 CYP2J2不同表達(dá)組腫瘤患者的生存曲線

圖3 EETs不同表達(dá)組腫瘤患者的生存曲線

表2 肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的單因素Cox回歸分析

RR：相對危險(xiǎn)度

表3 肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間的多因素Cox回歸分析

RR：相對危險(xiǎn)度

表4 肝細(xì)胞癌中CYP2J2和EETs蛋白表達(dá)的相關(guān)性

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HCC中EETs低表達(dá)組患者的生存期高于EETs高表達(dá)組，這與Nithipatikom等[15]觀點(diǎn)一致，認(rèn)為EETs低表達(dá)患者的生存時(shí)間高于EETs高表達(dá)患者。EETs高表達(dá)患者的預(yù)后更差，其原因可能是EETs通過直接刺激腫瘤細(xì)胞生長和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)和體外促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展，因此當(dāng)EETs表達(dá)上調(diào)，腫瘤細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的病情發(fā)展較快，影響患者的治療和預(yù)后[16]。EETs抑制劑可通過破壞線粒體，激活c-Jun NH2-末端激酶、Caspase-3和胱天蛋白酶-9促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。單因素和多因素回歸分析結(jié)果顯示，EETs、CYP2J2均為影響HCC患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素。經(jīng)相關(guān)性分析顯示，EETs和CYP2J2的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，提示兩者在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中共同發(fā)揮作用。因此，EETs和CYP2J2均可能成為HCC患者的治療靶點(diǎn)，通過特異阻斷兩者的功能，延緩病情的進(jìn)展，改善HCC患者的預(yù)后。另外，對于HCC患者，可通過檢測EETs和CYP2J2蛋白的表達(dá)狀態(tài)，對HCC患者的預(yù)后進(jìn)行評估。

綜上所述，CYP2J2和EETs表達(dá)狀態(tài)與HCC臨床病理特征具有明顯相關(guān)性；且CYP2J2、EETs為影響HCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。CYP2J2和EETs能為HCC患者的診療及預(yù)后預(yù)測提供參考依據(jù)。