新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋胃黏液腺癌組織中miRNA表達(dá)譜的比較

張夢(mèng)嵐，賀菊香，潘 莉，鞏 雪，王豐梅

我國(guó)胃癌的病死率位居全部惡性腫瘤的第2位[1]。自1993年miRNA被首次報(bào)道以來(lái)[2]，miRNA與腫瘤的研究取得了較大的進(jìn)展。在胃癌中的研究顯示，miRNA在胃癌的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，而且參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的療效、臨床病理特征及預(yù)后等關(guān)系十分密切[3-4]，所以miRNA很有可能成為胃癌早期篩查、預(yù)后判斷及療效評(píng)估的標(biāo)志和靶點(diǎn)。但由于樣本保存方法、病理類型、研究方法或樣本來(lái)源地域差異等各種原因，導(dǎo)致胃癌組織中miRNA的研究結(jié)論不完全一致，甚至出現(xiàn)互相矛盾的結(jié)果[5-7]。因此，本實(shí)驗(yàn)用miRNA芯片技術(shù)對(duì)新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋配對(duì)的同一組織學(xué)類型的胃黏液腺癌組織中miRNA的表達(dá)譜，進(jìn)行了篩查對(duì)比和統(tǒng)計(jì)分析，以初步探討不同方法保存的同一胃癌組織類型中miRNA的表達(dá)普是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來(lái)自2017年在青海省人民醫(yī)院手術(shù)的胃癌患者，合計(jì)6例。新鮮冷凍組織由手術(shù)醫(yī)師在手術(shù)過(guò)程中切取，并將所取組織塊分為2份，一份迅速放入液氮罐中冷凍，后期轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存。一份由福爾馬林固定石蠟包埋以便后期病理學(xué)核實(shí)是否切取到腫瘤及腫瘤組織所占整塊組織的比例(腫瘤組織占比)。福爾馬林固定石蠟包埋組織是經(jīng)10%中性福爾馬林固定，由病理醫(yī)師取材后石蠟包埋而成的常規(guī)蠟塊。所取組織塊的質(zhì)量均約為100 mg。術(shù)中所取的新鮮組織和福爾馬林固定石蠟包埋組織經(jīng)切片、染色后，由臨床病理醫(yī)師進(jìn)行復(fù)診，挑選癌組織占比均在50%以上，胃癌組織學(xué)類型均為胃黏液腺癌，并且患者術(shù)前未行任何放、化療的6對(duì)配對(duì)樣本進(jìn)行芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，并采集臨床病理資料。6例樣本的基本信息、病理特征及腫瘤組織在取材組織塊中所占的比例情況見(jiàn)表1。

1.2 LC Sciences 芯片雜交實(shí)驗(yàn)基本過(guò)程 提取新鮮冷凍和石蠟包埋組織樣本的總RNA，用Agilent 2100 bioanalyzer進(jìn)行RNA數(shù)量和質(zhì)量的測(cè)定，質(zhì)檢合格后樣本進(jìn)行芯片微陣列雜交實(shí)驗(yàn)。

微陣列實(shí)驗(yàn)由LC Sciences公司進(jìn)行。微陣列實(shí)驗(yàn)使用5 μg總RNA樣本。使用Poly(A)聚合酶在總RNA 3′端加上Poly(A)尾巴，再將一個(gè)寡聚核苷酸標(biāo)記與該P(yáng)oly(A)尾巴連接用于后續(xù)的熒光標(biāo)記。雜交反應(yīng)利用微循環(huán)泵在μParaflo微流體芯片上過(guò)夜進(jìn)行。雜交使用含有25%甲酰胺的100 μL 6×SSPE緩沖液，雜交溫度為34 ℃。RNA與探針雜交后，與標(biāo)記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行染色。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過(guò)濾后進(jìn)行信號(hào)歸一化?？俁NA的提取，質(zhì)量檢測(cè)，芯片雜交及結(jié)果分析均由杭州聯(lián)川生物公司完成。

表1 6例樣本的基本信息、臨床病理特征及腫瘤組織的占比

1.3 數(shù)據(jù)處理 激光掃描儀采集芯片雜交圖像后進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換，然后原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景值減除，轉(zhuǎn)化為以2為底的對(duì)數(shù)(log2)，利用Transcriptome AnalysisConsole(美國(guó)Affymetrix公司)軟件進(jìn)行差異分析檢出兩組樣本差異表達(dá)的miRNA，然后采用t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并對(duì)新鮮冷凍和石蠟包埋樣本的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行Pearson相關(guān)性及主成分分析(principal component analysis，PCA)分析，評(píng)估配對(duì)樣本間miRNA表達(dá)譜的相關(guān)性及樣本聚類情況。

2 結(jié)果

2.1 新鮮冷凍與福爾馬林固定石蠟包埋胃癌樣本中提取總RNA的質(zhì)量及含量檢測(cè) 兩組樣本提取總RNA后經(jīng)Agilent 2100 bioanalyzer檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，術(shù)中取材后立即投入液氮后轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱保存的新鮮冷凍樣本中提取的總RNA質(zhì)量較高，6個(gè)樣本均有不同峰值的28 S和18 S波峰，完整度符合28 S是18 S的1～2倍范圍要求(圖1)。福爾馬林固定石蠟包埋樣本中提取的總RNA有相對(duì)比較明顯的降解，在6個(gè)樣本中28 S和18 S的波峰均不明顯(圖2)。提取的樣本RNA雖有部分降解，但在miRNA近25 nt處波峰明顯，說(shuō)明兩組標(biāo)本中的miRNA保存度完整，達(dá)到miRNA芯片雜交要求，可以進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。

2.2 芯片檢測(cè)配對(duì)新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋胃癌組織中的miRNA表達(dá)譜 芯片雜交完成后，進(jìn)行圖像掃描，轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)并進(jìn)行背景及歸一化處理后數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)新鮮冷凍組織和福爾馬林固定石蠟包埋兩組樣本中miRNA的表達(dá)譜差異有顯著性，如果以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)則兩組差異表達(dá)的miRNA有114個(gè)(圖3)。如果P<0.01為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，則兩組有顯著差異表達(dá)的miRNA有16個(gè)(圖4)。

圖1 新鮮冷凍標(biāo)本中提取的總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果：A～F.樣本1～6的新鮮冷凍標(biāo)本，縱坐標(biāo)FU為熒光值，橫坐標(biāo)nt為核苷酸數(shù)

圖2 福爾馬林固定石蠟包埋樣本中提取的總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果：A～F.樣本1～6的福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本，縱坐標(biāo)FU為熒光值，橫坐標(biāo)nt為核苷酸數(shù)

圖3 新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中差異表達(dá)的miRNA聚類圖(P<0.05)

圖4 新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中差異表達(dá)的miRNA聚類圖(P<0.01)

2.3 miRNA芯片雜交數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果按差異倍數(shù)再篩選 miRNA芯片雜交數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果在篩選差異表達(dá)的miRNA時(shí)除了考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)的檢驗(yàn)水準(zhǔn)P值以外，另一重要的因素就是Fold Chang即差異倍數(shù)，比較組和對(duì)照組基因表達(dá)量平均值的差異倍數(shù)越大，說(shuō)明差異越顯著。常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)是Fold Change (log2)≥1或Fold Change(log2)≤-1。為了顯示兩組間差異更顯著的miRNA，常用的標(biāo)準(zhǔn)是Fold Change的絕對(duì)值≥2。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以Fold Change的絕對(duì)值≥2進(jìn)行再次篩選，結(jié)果兩組間分別有76個(gè)(P<0.05)和14個(gè)(P<0.01)miRNA呈顯著差異表達(dá)。

2.4 檢測(cè)樣本miRNA表達(dá)譜的PCA PCA分析結(jié)果所示(圖5)，主成分1(PC1)、主成分2(PC2)的累積貢獻(xiàn)率達(dá)90%。從圖中看出miRNA表達(dá)譜因樣本是新鮮冷凍或石蠟包埋的類型不同而有所差異，并且6例福爾馬林固定石蠟包埋樣本比新鮮冷凍樣本miRNA的表達(dá)譜聚類更好，即新鮮冷凍組的離散度比福爾馬林固定石蠟包埋組大，尤其是新鮮冷凍組的4號(hào)和6號(hào)樣本的離散度較大。

2.5 Pearson檢驗(yàn) 為測(cè)定配對(duì)新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋胃癌樣本基因表達(dá)譜的一致性，進(jìn)行了Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)(圖6)。配對(duì)的新鮮冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中樣本1、2、3、4、5對(duì)之間呈極強(qiáng)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)樣本1為0.95，樣本2為0.97，樣本3為0.99，樣本4為0.97，樣本5為0.81)，樣本6為強(qiáng)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)為0.69)。

圖5 樣本miRNA表達(dá)譜的PCA分析

圖6 Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)圖

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤均存在miRNA表達(dá)失調(diào)，這些異常表達(dá)的miRNA可參與腫瘤的發(fā)生、分化、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫反應(yīng)等。miRNA的研究實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用含高質(zhì)量RNA的新鮮冷凍樣本。然而，新鮮冷凍組織的取材、保存和運(yùn)輸工作均比較困難，而福爾馬林固定石蠟包埋的樣本不僅有大量的病理資料，且保存時(shí)間較長(zhǎng)，應(yīng)該是人類研究疾病的寶貴資源庫(kù)，尤其是在回顧性研究和少見(jiàn)疾病的研究中可以發(fā)揮重要作用。所以，許多研究者想利用這類大量?jī)?chǔ)存在醫(yī)院組織庫(kù)中且?guī)в性敿?xì)的臨床資料的福爾馬林固定石蠟包埋組織作為樣本，并有研究認(rèn)為在miRNA實(shí)驗(yàn)中，因miRNA跟長(zhǎng)鏈RNA或DNA相反，因長(zhǎng)度較短(19～25 nt)，成熟miRNA的降解似乎不受福爾馬林固定的影響[8]，因此福爾馬林固定石蠟包埋樣本適用于miRNA的表達(dá)研究[9-10]。也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本在腎、前列腺、乳腺等不同組織中研究miRNA表達(dá)的可行性[11]。另有學(xué)者認(rèn)為福爾馬林固定石蠟包埋樣本在制備和儲(chǔ)存過(guò)程不可避免地會(huì)降解RNA[12]，導(dǎo)致RNA碎裂，所以福爾馬林固定石蠟包埋組織中核酸不適合用于基因表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)[13]。

為此，本實(shí)驗(yàn)在美國(guó)Affymatrix公司全基因組表達(dá)譜芯片上用配對(duì)的6例新鮮冷凍和6例福爾馬林固定石蠟包埋的胃黏液腺癌樣本進(jìn)行miRNA的芯片雜交和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)篩選后發(fā)現(xiàn)Fold Change的絕對(duì)值≥2為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果兩組間有顯著差異表達(dá)的miRNA分別有76個(gè)(P<0.05)和14個(gè)(P<0.01)。該結(jié)果提示配對(duì)的新鮮冷凍和石蠟包埋的同一組織學(xué)類型的胃癌組織miRNA表達(dá)譜存在差異性，即新鮮冷凍組織樣本中miRNA基因的表達(dá)量不能準(zhǔn)確轉(zhuǎn)化為福爾馬林固定石蠟包埋樣本中的表達(dá)量，因此，如果研究直接利用福爾馬林固定石蠟包埋樣本中miRNA基因的絕對(duì)表達(dá)值，可能得到的結(jié)果不太準(zhǔn)確，文獻(xiàn)指出得到更多的可能是與降解相關(guān)的信息[14]。

從本組miRNA表達(dá)譜的相關(guān)性分析看出，配對(duì)標(biāo)本新鮮冷凍與福爾馬林固定石蠟包埋樣本呈高度相關(guān)(r值均大于0.65)，配對(duì)樣本6相關(guān)性相對(duì)較低，可能與樣本6新鮮冷凍(腫瘤組織占65%)與福爾馬林固定石蠟包埋樣本(腫瘤組織占100%)中的腫瘤細(xì)胞占比差異較大有關(guān)。聚類分析顯示，新鮮冷凍組的4號(hào)和6號(hào)樣本的離散度較大，在樣本原始病理資料中顯示這2例樣本中腫瘤組織的占比較低，而聚類很好的福爾馬林固定石蠟包埋樣本由病理醫(yī)師在診斷取材過(guò)程中獲得，比在手術(shù)過(guò)程中的取材更準(zhǔn)確，腫瘤組織占比更高，所以推測(cè)新鮮冷凍標(biāo)本的離散度較大與腫瘤組織的占比較低有關(guān)。所以在腫瘤組織核酸表達(dá)的研究中組織在鏡下的形態(tài)學(xué)檢查十分重要，樣本中所含的腫瘤壞死區(qū)、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度或非腫瘤細(xì)胞占比等均可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的正確性。該結(jié)論亦被de Biase等[11]的研究證實(shí)。Gao等[15]的實(shí)驗(yàn)亦分析出很多miRNA與研究結(jié)論不一致，原因之一可能是標(biāo)本收集標(biāo)準(zhǔn)的差異。

以上結(jié)果提示如果取材準(zhǔn)確，福爾馬林固定石蠟包埋樣本和新鮮冷凍樣本之間的miRNA表達(dá)譜高度相關(guān)，即福爾馬林固定石蠟包埋樣本同樣可用于基因表達(dá)分析。所以有文獻(xiàn)進(jìn)一步指出兩組樣本內(nèi)絕大部分基因間表達(dá)水平的相對(duì)大小關(guān)系不受降解的影響[16]，因此可以利用福爾馬林固定石蠟包埋樣本用于基因表達(dá)高低相對(duì)關(guān)系的研究。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新鮮冷凍樣本和福爾馬林固定石蠟包埋樣本中miRNA的表達(dá)雖然有很高的相關(guān)性，但兩者miRNA的表達(dá)譜中有114個(gè)(P<0.05)和16個(gè)(P<0.01)存在顯著差異。同時(shí)，另指出在配對(duì)的肺腺癌、浸潤(rùn)性乳腺癌和結(jié)腸癌中，福爾馬林固定石蠟包埋樣本與新鮮冷凍樣本相比，其上千基因的表達(dá)檢測(cè)值均至少有2倍的改變[16]。在扁桃體腫瘤中的研究中比較了新鮮冷凍標(biāo)本和福爾馬林固定石蠟包埋標(biāo)本的miRNA表達(dá)譜，雖然兩組之間表達(dá)的miRNA相關(guān)性較好，但差異表達(dá)的miRNA重疊程度亦不理想[17]。所以利用福爾馬林固定石蠟包埋組織也不太適合用于全部核酸相對(duì)表達(dá)量的研究，推測(cè)可能不同miRNA穩(wěn)定性有差異，有些更易被降解或轉(zhuǎn)化。

總之，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在腫瘤核酸表達(dá)的研究中，對(duì)取材樣本在鏡下核實(shí)腫瘤組織的占比非常重要；而且配對(duì)的福爾馬林固定石蠟包埋和新鮮冷凍組織中miRNA的表達(dá)存在顯著差異，如果在研究中用相對(duì)容易獲得且病理資料完整的福爾馬林固定石蠟包埋組織作為研究材料，那么可能會(huì)由于甲醛固定處理過(guò)的石蠟包埋塊標(biāo)本經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的保存，miRNA可能發(fā)生了核酸與蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，單甲基化基團(tuán)的修飾等過(guò)程，導(dǎo)致miRNA發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化，所以采用福爾馬林固定石蠟包埋組織中miRNA基因的絕對(duì)表達(dá)值，結(jié)論可能不太準(zhǔn)確，可能會(huì)導(dǎo)致某些miRNA的丟失從而影響早期胃癌篩查的關(guān)鍵性分子標(biāo)志物miRNA的檢出及下游逆轉(zhuǎn)錄和基因表達(dá)定量分析。本實(shí)驗(yàn)及其他報(bào)道均顯示新鮮冷凍與福爾馬林固定石蠟包埋組織miRNA的表達(dá)譜呈高度的相關(guān)性，但用福爾馬林固定石蠟包埋組織作為研究材料能否反映全部miRNA基因的相對(duì)表達(dá)仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去證實(shí)。