制備一種由純化學成分合成的伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基

尉文霞 鄧自新 孟媛

摘? 要：比較評價三種配方的伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB），篩選出一種培養(yǎng)效果優(yōu)，成本低的純化學合成培養(yǎng)基，消除現市售伊紅美藍培養(yǎng)基中因蛋白胨營養(yǎng)成分不明確對菌落生長帶來的干擾，提高結果準確率。以20種氨基酸為氮源，3個濃度（8.08g、10.0g、20.0g）代替現市售伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中的動植物源性蛋白胨成分，制成純化學合成伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，比較多種菌株在此培養(yǎng)基上的顏色、菌落形態(tài)及生長率。結果表明大腸埃希菌在EMB-1、EMB-2、EMB-3和市售EMB上生長良好，菌落呈黑色，有或無金屬光澤，生長率均大于0.7;金黃色葡萄球菌均受到抑制，生長微弱或不生長;沙門氏菌的生長率在自配EMB與市售EMB上相差不大，均為無色菌落。使用全自動生化鑒定儀分析EMB-1和市售EMB上的大腸埃希菌，結果63項生化試驗完全一致。綜合菌落形態(tài)特征、生長率、生化反應、原料成本等因素，選擇第1種配方（10.0g）的純化學合成伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基，為純化學參考物質體系的建立提供一定的數據及實物支撐。

關鍵詞：純化學伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基;大腸埃希菌;動植物源性蛋白胨

中圖分類號：Q93? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? 文章編號：2095-2945（2020）15-0001-06

Abstract： By comparing and evaluating the three formulations of eosin methylene blue （EMB） agar medium， a pure chemical synthesis medium with excellent culture effect and low cost was selected to eliminate the interference to colony growth caused by unclear nutritional composition of peptone in eosin methylene blue agar medium sold in the market， and improve the accuracy of the results. The pure chemical synthetic eosin methylene blue agar medium was prepared using 20 kinds of amino acids as nitrogen source and 3 concentrations （8.08g， 10.0g， 20.0g） instead of animal and plant-derived peptone in eosin methylene blue Agar. The color， colony morphology and growth rate of many strains on this medium were compared. The results showed that Escherichia coli grew well on EMB-1， EMB-2， EMB-3 and commercial EMB， the colony was black， with or without metallic luster， the growth rate was more than 0.7; Staphylococcus aureus was inhibited， the growth rate of salmonella was weak or non-growing， and the growth rate of salmonella was almost the same in self-made EMB and commercial EMB， all were colorless colonies. Using automatic biochemical analyzer to analyze Escherichia coli on EMB-1 and commercial EMB， the results of 63 biochemical tests were consistent. Considering the colony morphological characteristics， growth rate， biochemical reaction， raw material cost and other factors， the first formula （10.0g） pure chemical synthetic eosin methylene bluec agar medium was selected to provide some data and physical support for the establishment of pure chemical reference material system.

Keywords： pure chemical eosin-methylene blue （EMB） agar medium; Escherichia coli; animal or plant peptone

大腸埃希菌（E. coli）即大腸桿菌，是醫(yī)院最常見的革蘭氏陰性致病菌[1]。原料加工過程、外包裝污染、生產環(huán)節(jié)或滅菌不夠徹底等原因都會導致大腸埃希菌超標，國內外通常將其作為食品藥品等衛(wèi)生狀況的指示菌。有研究報導革蘭氏陰性菌如大腸埃希菌等對多種藥物耐受[2]，因此提高檢驗結果的準確性非常必要。微生物培養(yǎng)在微生物研究中仍然是一個重大挑戰(zhàn)，純培養(yǎng)及其分離對于研究微生物形態(tài)、生理特性、基因序列、代謝功能及微生物生態(tài)效應是非常重要的[3]。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（eosin-methylene blue medium，簡稱EMB）用于革蘭氏陰性腸桿菌的分離、鑒定，特別是大腸桿菌的分離與鑒定。目前市售伊紅美藍培養(yǎng)基中均含有天然動植物源性或微生物源性蛋白胨，組成復雜且營養(yǎng)成分不明確，蛋白胨不同組成的培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物生長情況有明顯的差異[4-5]，對菌落生長及后續(xù)分析帶來許多干擾，并且難以人為控制。在2016年中國Wu X等人報道了一種培養(yǎng)間充質干細胞的無血清純化學合成培養(yǎng)基[6]。2016年趙新宇等人以高產納豆激酶的地衣芽孢桿菌基因工程菌BL10 （pP43SNT-SsacC）為出發(fā)菌株通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了全合成培養(yǎng)基[7]。目前的合成培養(yǎng)基只有西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、葡萄糖胺培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、Cary-Hlair氏運送培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、改良察氏培養(yǎng)基、高鹽察氏培養(yǎng)基和亞硝酸鹽蔗糖瓊脂。因此研發(fā)無動植物源性純化學成分的該種培養(yǎng)基迫在眉睫，且可以為我國食品純化學參考培養(yǎng)基體系的建立提供一定的數據及實物支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212、大腸埃希菌ATCC25922、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778、產氣腸桿菌ATCC13048、白色念珠菌 CMCC98001、福氏志賀氏菌CMCC51571為本實驗室保藏。

大腸埃希菌ATCC8739、大腸埃希菌CMCC44829、肺炎克雷伯菌CMCC46117、奇異變形桿菌 CMCC49005、肺炎克雷伯菌CICC24165、痢疾志賀氏菌CMCC51105由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 營養(yǎng)瓊脂、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物公司、北京三藥科技公司、北京陸橋技術股份有限公司、美國BD公司。

1.2.2 甘氨酸購自Alfa Aesar;丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸水合物、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸、天冬酰胺（游離）、半胱氨酸（游離）、谷氨酰胺（游離）、色氨酸（游離）、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、D-乳糖、伊紅、美藍購自Sigma;氯化鈉、尿素購自滬試;瓊脂購自北京奧博星生物公司。

1.3 工作菌懸液的制備

將大腸埃希菌 ATCC25922、ATCC8739、CMCC44829、 鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、CMCC50115、金黃色葡萄球菌ATCC6538、ATCC25923、糞腸球菌ATCC29212、肺炎克雷伯菌CMCC 46117、CICC24165、痢疾志賀氏菌 CMCC51105、福氏志賀氏菌CMCC51571、蠟樣芽孢桿菌 ATCC11778、產氣腸桿菌ATCC13048、奇異變形桿菌 CMCC49005、白色念珠菌 CMCC98001 接種到腦心浸出液肉湯、胰酪大豆胨瓊脂平板或沙氏葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)過夜。

1.4 劃線接種

將過夜菌稀釋約200 CFU/100？滋L，取稀釋好的菌懸液100？滋L，均勻涂布接種于待測平板和參比平板，平行接種2個平板，36℃培養(yǎng)18h～24h;取一環(huán)過夜培養(yǎng)的菌在平板上劃線， 36℃培養(yǎng)18h～24h。

1.5 培養(yǎng)基制備

將表1所示的20種氨基酸在渦旋儀上混合30min以上，將表1中的5種無機鹽在渦旋儀上混勻30min以上，以確保充分混勻，制備成蛋白胨替代物。按照表2稱量（自配1培養(yǎng)基以下簡稱EMB-1，自配2培養(yǎng)基以下簡稱EMB-2和自配3培養(yǎng)基以下簡稱EMB-3），溶于1000 mL蒸餾水中，調節(jié)pH至7.1±0.2，121℃高壓滅菌15 min，冷卻至55℃傾注平板備用[8]。

2 結果

2.1 試驗菌株在EMB上的顏色、菌落形態(tài)

選擇幾種醫(yī)院常見的革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、芽孢菌以及真菌等致病菌，將各菌種分別劃線接種于市售EMB、EMB-1、EMB-2、EMB-3平板上，通過比較其顏色、菌落形態(tài)及生長率來確定最優(yōu)配方。試驗結果見圖1。

大腸埃希菌ATCC8739在四種平板上均呈黑色菌落，生長良好，其中市售EMB平板上的金屬光澤最明顯，EMB-1金屬光澤比較明顯，EMB-2、EMB-3金屬光澤不明顯。志賀氏菌、奇異變形桿菌在四種培養(yǎng)基上均生長良好，菌落呈無色。產氣腸桿菌菌落為粉色，生長良好。肺炎克雷伯菌呈紫色粘液狀，生長良好或微弱，EMB-1上生長情況與市售EMB更為接近。革蘭氏陽性菌中的糞腸球菌與金黃色葡萄球菌在市售EMB和自配EMB-1、EMB-2和EMB-3培養(yǎng)基上生長均受到一定程度的抑制，微弱生長或不生長，其中EMB-1和EMB-2的抑制能力更強。

蠟樣芽胞桿菌ATCC11778在市售EMB和EMB-1均生長良好，白色菌落，不透明，EMB-2生長微弱而EMB-3不生長。白色念珠菌CMCC98001在市售EMB和EMB-1均生長良好，而在EMB-2和EMB-3上生長微弱。

2.2 試驗菌株在EMB培養(yǎng)基上的生長率對比

選取革蘭氏陰性菌大腸埃希菌ATCC25922、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌ATCC6538，分別測定其在市售EMB、EMB-1、EMB-2和EMB-3上的PR值，結果如圖2所示，在自配的三種EMB與市售EMB上，大腸埃希菌生長良好，菌落形態(tài)一致，在EMB-1、EMB-2、EMB-3和市售EMB上的PR值均大于0.7，符合GB4789.28-2013[9]要求。鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028在EMB-1、EMB-2和EMB-3上的PR值與市售的相差不多，說明自配的培養(yǎng)基可以達到促鼠傷寒沙門氏菌生長。金黃色葡萄球菌在某些廠家的市售EMB上的生長率達到0.8以上，有些廠家的生長率為0或0.01，而在自配的三種培養(yǎng)基上均不生長，說明現市售培養(yǎng)基的質量參差不齊，自配培養(yǎng)基均可以抑制金黃色葡萄球菌的生長，且抑制效果好。

綜合結果1和結果2，EMB-1上大腸埃希菌的生長率在0.7以上，而且各菌種的生長特性與市售的更加接近，因此EMB-1配方的各成分濃度更適合，使用原料較少，培養(yǎng)菌株效果較好，可以節(jié)約成本，節(jié)約資源。

2.3 試驗菌株在自配EMB-1培養(yǎng)基上的顏色、菌落形態(tài)

為了進一步驗證自配EMB-1培養(yǎng)基的微生物功能，我們將EMB-1和市售EMB上培養(yǎng)的大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC6538和鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028顏色、菌落形態(tài)進行對比，大腸埃希菌ATCC25922在EMB-1上的菌落大小、形狀與市售EMB一致，黑色菌落，金屬光澤出現時間較市售EMB晚，且與菌落濃度有關，接種量越多，金屬光澤越明顯。能否出現金屬光澤與培養(yǎng)基的酸堿性密切相關，有文獻報導EMB上最早觀察到金屬光澤的是3.3h～10h[10]。金黃色葡萄球菌

ATCC6538生長受到抑制，不生長或微弱生長，鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028菌落無色，生長良好。

2.4 試驗菌株在自配EMB-1培養(yǎng)基上的生長率測定

選取大腸埃希菌CMCC44829，肺炎克雷伯菌CMCC44167，沙門氏菌CMCC51105三種菌株對EMB-1的促生長能力與市售EMB培養(yǎng)基進行比對，結果顯示，三種菌株的生長率在市售EMB和EMB-1培養(yǎng)基上無顯著差異，其中大腸埃希菌的生長率達到0.7以上，與GB4789.28-2013[9]國標要求一致。

2.5 大腸埃希菌在EMB-1和市售EMB上的生化試驗比較

將自配EMB-1和市售EMB平板上生長的大腸埃希菌轉接到胰酪大豆胨瓊脂平板上，挑取菌落制成濃度為0.5～0.7的菌懸液，使用全自動生化鑒定儀VITEK 2進行鑒定，結果發(fā)現63項生化試驗結果完全一致，這個結果表明自配EMB-1培養(yǎng)基適合大腸埃希菌生長，其明顯生化特征不變。

3 討論

目前越來越多的人研究不同來源的蛋白胨或其替代物作為微生物生長氮源，以便節(jié)約資源，提高一些廢物利用率，但絕大部分蛋白胨都是營養(yǎng)成分不確定的提取物[4，11-12]，可能對一些微生物生長或后續(xù)分析帶來干擾。吳桂秀等人利用無機氮源和有機氮源培養(yǎng)標志鏈帶藻，均能生長良好[13]。本文旨在研究一種由純化學合成，組成成分明確的蛋白胨來替代市售EMB中的蛋白胨，以提高檢測結果的準確性。

伊紅和美藍對革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有抑制作用并且有酸堿指示劑的功能。大腸埃希菌可以分解利用培養(yǎng)基中的乳糖產酸，進而與伊紅結合導致菌落呈現深紫色或黑色[14]。在本研究的結果1和結果3中，大腸埃希菌在純化學合成EMB、市售EMB平板上均生長良好，菌落特征基本一致，深紫色或黑色菌落，有或無金屬光澤，其生化試驗結果也一致。而沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌因不能利用培養(yǎng)基中的乳糖，所以不產酸，在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落呈無色，這與結果1和3中的描述是一致的。GB4789.28-2013[9]要求大腸埃希菌的生長率需達到0.7以上，在EMB-1培養(yǎng)基上，結果2顯示大腸埃希菌ATCC25922的生長率為0.92，結果4中的大腸埃希菌CMCC44829的生長率達到0.87，遠遠超出國標要求的0.7。說明本文中的EMB-1的促生長能力可以達到國標要求。有文章報道用EMB培養(yǎng)基分離純化白色念珠菌及一些酵母菌[15-16]，因此本文中也將純化學合成EMB上生長的白色念珠菌與市售EMB進行對比，均為白色菌落。

革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌濃度低時在自配培養(yǎng)基上不生長而在市售培養(yǎng)基上生長，說明其抑制作用優(yōu)于某些現市售EMB。在進行大腸埃希氏菌分離鑒定時，可以消除增菌液中革蘭氏陽性菌的干擾，提高檢出率，增加試驗準確性，為我國參考培養(yǎng)基體系的建立提供基礎。

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