雞源益生菌對腸道病原菌的體外拮抗作用

劉歡歡 劉珍珠 王玉榮

摘要：為探究雞源益生菌對雞腸道病原菌的影響，從健康的土雞腸道內(nèi)分離并鑒定出6株乳酸菌（Lactobacillus plantarum）和1株丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。以從腹瀉病雞腸道內(nèi)分離并鑒定的3株病原菌——大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella enterica）和志賀氏菌（Shigella sonnei）為指示菌，采用平板抑菌法挑選出1株抑菌活性強的乳酸菌;將這株乳酸菌和丁酸梭菌用比濁法測定48 h內(nèi)的生長曲線和pH值變化曲線;采用體外模擬腸道的方式，將2株益生菌分別與3株致病菌做體外拮抗試驗。結(jié)果顯示，乳酸菌R5和R6的抑菌能力最強，選取R5與丁酸梭菌D2研究其體外對致病菌的拮抗性能。體外拮抗研究表明，在72 h內(nèi)乳酸菌R5可將病原菌完全殺滅，而丁酸梭菌對3種致病菌也均有顯著抑菌作用。發(fā)現(xiàn)乳酸菌和丁酸梭菌在體外拮抗作用中均有顯著的抑菌作用，而乳酸菌R5的抑菌效果更好。本研究結(jié)果可為益生菌的應用提供理論依據(jù)。

關鍵詞：益生菌;乳酸菌;丁酸梭菌;拮抗;腸道致病菌;共培養(yǎng)

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）06-0151-05

在禽類養(yǎng)殖行業(yè)中，抗生素一直是一種常用的飼料添加劑以防治禽類腸道疾病和促進生長，然而隨著抗生素的泛濫使用，也帶來了藥物殘留、病原微生物耐藥性增強和養(yǎng)殖環(huán)境惡化等負面影響[1]。益生菌以其成本低廉、效果好、綠色無害而備受青睞，可以減少抗生素施用甚至完全替代抗生素[2]。

乳酸菌和丁酸梭菌是廣泛應用于禽類的益生菌，它們能夠通過多種機制對腸道屏障進行調(diào)節(jié)以抑制病原微生物在腸道內(nèi)定植和生長，有的還可以通過分泌抗菌物質(zhì)殺滅有害微生物，因此對細菌引起的腹瀉等疾病能起到良好的預防和治療作用[3]。

本研究通過從無抗生素喂養(yǎng)的健康土雞腸道中分離出乳酸菌和丁酸梭菌，以從腹瀉病雞中分離的致病菌為指示菌，篩選出作用較強的益生菌，并研究體外共培養(yǎng)中對致病菌的殺滅作用，為益生菌的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 益生菌分離自烏魯木齊南山某個體養(yǎng)殖戶無抗生素喂養(yǎng)的健康土雞;致病菌分離自某養(yǎng)殖場腹瀉的病雞。

1.1.2 培養(yǎng)基 病原菌增菌培養(yǎng)基：NB和NA（固體）;乳酸菌分離培養(yǎng)基：MRS瓊脂（添加0.75% CaCO3）;乳酸菌增菌培養(yǎng)基：MRS肉湯;梭菌選擇培養(yǎng)基：TSN瓊脂;強化梭菌液體培養(yǎng)基：RCM培養(yǎng)基;大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基：EMB瓊脂;沙門氏菌與志賀氏菌鑒別培養(yǎng)基：SS瓊脂;均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 單人雙面凈化工作臺（SW-CJ-1F）;恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-2102C）;電熱恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250BF2）;立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-75 SII）;電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9070）。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離

1.2.1.1 致病菌的分離 將腹瀉病雞頸靜脈放血處死后，用無菌器械進行解剖，截取盲腸，取盲腸內(nèi)容物1 g，溶于9 mL 0.85%無菌生理鹽水，充分振蕩混勻后，取上清液1 mL依次稀釋至10-6，將10-5、10-6稀釋液取100 μL均勻涂布于SS平板和EMB平板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h，EMB上挑選圓潤深紫色且有綠色金屬光環(huán)的菌落[4]，SS平板挑取帶有黑點的透明菌落和透明或半透明的菌落[5]，對菌落劃線純化后，進行生理生化檢測和16S rDNA鑒定。

1.2.1.2 乳酸菌的分離 將土雞頸靜脈放血處死后，采用無菌器械對土雞進行解剖，剪下完整腸道，取盲腸內(nèi)容物1 g，稀釋方法同“1.2.1.1”節(jié)，稀釋至10-7，取10-6、10-7的稀釋液100 μL均勻涂布于含有0.75% CaCO3的MRS平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑選有溶鈣圈且形態(tài)不一的菌落[6]，劃線純化培養(yǎng)后，進行生理生化檢測和16S rDNA鑒定。

1.2.1.3 丁酸梭菌的分離 取健康土雞腸道的小腸部分腸段，用無菌湯匙，刮取小腸黏液，溶于9 mL 0.85%無菌生理鹽水中，振蕩混勻后，于80 ℃水浴鍋中水浴10 min，以去除非芽孢細菌，稀釋方法同“1.2.1.1”節(jié)，稀釋至10-3，取10-2和10-3稀釋液100 μL，均勻涂布于TSN平板[7]，37 ℃厭氧培養(yǎng)至長出菌落，選取疑似丁酸梭菌的菌落，于RCM液體培養(yǎng)基內(nèi)富集培養(yǎng)，選取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的菌液進行稀釋涂布純化，并進行生理生化檢測及16S rDNA的鑒定。

1.2.2 平板打孔法抑菌試驗

1.2.2.1 乳酸菌的抑菌試驗 將篩選到的乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)活化24 h，致病菌在普通液體培養(yǎng)基（NB）搖床培養(yǎng)16 h，取滅菌后的營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基冷卻至46 ℃左右，接入1%的致病菌，混勻后，無菌超凈工作臺下倒平板，待平板冷卻凝固后，用打孔器打孔，每個孔內(nèi)添加100 μL的乳酸菌菌液，常溫下靜置3 h后，置于37 ℃培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。測量每種乳酸菌的抑菌圈，選擇抑菌圈效果最明顯的菌株，用于后續(xù)共培養(yǎng)試驗。

1.2.2.2 丁酸梭菌的抑菌試驗 將篩選到的丁酸梭菌接入RCM液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基加滿至錐形瓶瓶口2～3 cm處，采用無菌石蠟-凡士林封口，靜置培養(yǎng)活化24 h，抑菌實驗方法同上。

1.2.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用IBM SPSS Statistics 22軟件分析，采用“x±s”表示。

1.2.3 乳酸菌與丁酸梭菌生長性能和pH值的測定 將抑菌效果較好的乳酸菌與丁酸梭菌活化 24 h，分別接種于裝有10 mL MRS液體培養(yǎng)基和 10 mL RCM液體培養(yǎng)基試管各54支，RCM培養(yǎng)基接種完丁酸梭菌后，用滅菌的石蠟-凡士林封口，37 ℃ 靜置培養(yǎng)，分別于0.0、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0、24.0、28.0、36.0、48.0 h時各取出3支，測定pH值和D600 nm值，采用Excel 2007軟件繪制生長曲線和pH值曲線。

1.2.4 益生菌與致病菌的共培養(yǎng)試驗

1.2.4.1 乳酸菌與致病菌的共培養(yǎng)試驗 將乳酸菌和致病菌活菌數(shù)目稀釋至同一數(shù)量級后，取裝有9 mL MRS液體培養(yǎng)基的無菌試管，以1/10接種量接入致病菌作為對照;另取裝有8 mL MRS液體培養(yǎng)基的無菌試管，其中3支以1 ∶ 1比例接入乳酸菌與致病菌各1 mL，每組3個重復，靜置培養(yǎng)，每隔 24 h 取出致病菌純培養(yǎng)液，和致病菌與乳酸菌混合培養(yǎng)液，并用SS與EMB平板計數(shù)，計算每支試管內(nèi)致病菌的活菌數(shù)。

1.2.4.2 丁酸梭菌與致病菌的共培養(yǎng)試驗 丁酸梭菌與致病菌共培養(yǎng)的方法同“1.2.4.1”節(jié)。

1.2.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用IBM SPSS Statistics 22軟件分析，并使用Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離鑒定

從健康土雞中分離出6株乳酸菌和1株丁酸梭菌，從腹瀉病雞腸道內(nèi)分離出3株致病菌。經(jīng)過生理生化檢測和16S rDNA分子鑒定后，3株致病菌分別為沙門氏菌、大腸桿菌和志賀氏菌;6株乳酸菌包括2株植物乳桿菌，1株糞腸球菌，1株乳酸片球菌，1株海氏腸球菌及1株腸膜明串球菌。16S rDNA鑒定結(jié)果及系統(tǒng)進化樹見表1和圖1。

2.2 平板抑菌試驗

6株乳酸菌和1株丁酸梭菌對大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑菌效果見表2。由表2可知，除R9菌株在大腸桿菌和沙門氏菌平板上無抑菌圈外，6株乳酸菌對3種致病菌均不同程度的抑菌效果;其中，R5和R6對3種致病菌的抑菌效果最好，具有顯著性差異（P<0.05）。而丁酸梭菌D2對3種致病菌的抑菌效果最弱，沒有明顯的抑菌圈。

R9在大腸桿菌和沙門氏菌平板上沒有抑菌圈，但是對志賀氏菌卻有微弱的抑菌效果;R2菌株對3種致病菌都有抑菌能力，但是抑菌效果顯著弱于R3和R4（P<0.05）;R3和R4之間的抑菌效果沒有明顯差異（P>0.05），它們對大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑菌效果較強;而R5和R6菌株對大腸桿菌和志賀氏菌的抑菌能力最強，具有顯著性差異（P<0.05），其中R5的抑菌圈直徑最大，分別達到8.33 mm和9.67 mm。

對于大腸桿菌，抑菌效果最好的菌株為R5和R6，抑菌圈直徑分別為8.33 mm和8.00 mm;在沙門氏菌的抑菌試驗中，效果明顯較強的菌株為R3、R4、R5和R6，抑菌圈直徑分別為9.66、10.66、966、9.66 mm;對志賀氏菌抑制作用較強的菌株也是R5和R6，抑菌圈直徑分別為9.67、9.00 mm。因此，R5和R6針對3種致病菌的綜合效果更強于其他菌株。

R5和R6菌株在培養(yǎng)過程中，因R5生長速率強于R6，因此取R5菌株用于后續(xù)共培養(yǎng)試驗。

2.3 乳酸菌和丁酸梭菌的生長曲線、pH值曲線

2.3.1 乳酸菌的生長曲線和pH值曲線 乳酸菌R5的生長曲線和pH值曲線見圖2。由圖2可知，0～2 h為該菌株的遲滯期，菌株的數(shù)目和pH值無變化，2 h后進入對數(shù)期，菌數(shù)目呈直線快速增長，由于菌數(shù)增多，產(chǎn)代謝物乳酸也越多，pH值隨之迅速下降，當pH值降低至3.8左右時，乳酸菌的生長由于酸抑制而停滯，在16 h后逐漸穩(wěn)定，到達穩(wěn)定期。

2.3.2 丁酸梭菌的生長曲線和pH值曲線 丁酸梭菌D2的生長曲線和pH值曲線見圖3。由圖3可知，前4 h為丁酸梭菌的遲滯期，4 h后進入對數(shù)期，菌數(shù)快速增長，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)越來越多，pH值快速下降至 4.7～4.8，菌數(shù)不再增長，12 h進入穩(wěn)定期。

2.4 益生菌與致病菌共培養(yǎng)試驗

2.4.1 乳酸菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌體外共培養(yǎng)試驗 乳酸菌R5分別與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的共培養(yǎng)體系中，大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的數(shù)量明顯下滑，與致病菌純培養(yǎng)對比極為明顯，具有極顯著差異（P<0.01）;在 24 h 時，混合體系的致病菌已被乳酸菌R5抑殺了4個數(shù)量級;48 h時，大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌濃度已減少至100 CFU/mL左右;直至72 h，各混合體系中致病菌已被完全殺滅。從以上結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，乳酸菌R5分別和大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌 1 ∶ 1 共培養(yǎng)，72 h內(nèi)可完全殺滅致病菌，體外抑菌作用很強（圖4）。

2.4.2 丁酸梭菌分別與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌體外共培養(yǎng)試驗 丁酸梭菌D2與大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌混合共培養(yǎng)時，D2雖然不能對大腸桿菌起到殺滅的作用，卻能明顯地抑制致病菌的生長速度。D2與大腸桿菌共培養(yǎng)24 h時，純培養(yǎng)對照組的大腸桿菌與混合體系中的大腸桿菌活菌數(shù)相差并不明顯，無顯著性差異（P>0.05）;培養(yǎng) 48 h 時，2組中的大腸桿菌數(shù)已明顯相差2個數(shù)量級，差異極顯著（P<0.01）;在72 h時，共培養(yǎng)體系中的大腸桿菌生長速度滯后于對照組（P<0.01）（圖5-a）。丁酸梭菌D2和沙門氏菌混合培養(yǎng)組與沙門氏菌單純對照組在72 h內(nèi)生長曲線相比，混合組的沙門氏菌生長明顯弱于對照組，2組沙門氏菌活菌數(shù)明顯相差1個數(shù)量級，在24、48 h均具有顯著性差異（P<0.05），而共培養(yǎng)72 h后，混合試驗組和對照組差異極顯著（P<0.01）（圖5-b）。D2與志賀氏菌共培養(yǎng)中，志賀氏菌的活菌數(shù)在平緩增長，生長趨勢明顯弱于志賀氏菌純培養(yǎng)對照組，在24、48、72 h均具有顯著性差異（P<0.05）。以上結(jié)果表明，丁酸梭菌的體外抑菌效果相比乳酸菌較弱，但對大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌的生長趨勢，具有明顯的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

乳酸菌和丁酸梭菌屬于動物腸道內(nèi)常見的益生菌，它們對于維持動物腸道微生態(tài)平衡、促進營養(yǎng)吸收和增強免疫系統(tǒng)能力都發(fā)揮著重要的作用。本研究中，從健康土雞腸道內(nèi)分離出的乳酸菌和丁酸梭菌對雞源性致病菌具有顯著的抑制作用。

萬榮峰等的研究表明，3株乳酸菌分別與大腸桿菌體外共培養(yǎng)，同時接菌時可在96 h內(nèi)殺滅所有大腸桿菌，提前接入乳酸菌后培養(yǎng)24 h，再接入病原菌，可在72 h內(nèi)將大腸桿菌完全殺滅[8]。陳丹等分

離的干酪乳桿菌在與禽致病大腸桿菌體外拮抗研究中表明，96 h內(nèi)可完全殺滅致病菌，而在培養(yǎng) 24 h 前，混合組大腸桿菌的數(shù)目與對照組差異并不顯著[9]。本研究中，乳酸菌R5菌株與大腸桿菌 1 ∶ 1 同時接入，72 h時可殺滅所有大腸桿菌;混合組大腸桿菌在前24 h就呈現(xiàn)出極顯著差異（P<001），R5菌株對禽致病菌沙門氏菌和志賀氏菌的殺滅作用差異同樣極顯著（P<0.01），這說明本研究中分離的R5菌株在體外拮抗致病菌方面較強，具有進一步研究和應用的價值。

謝樹貴等在酒窖底泥中分離出1株丁酸梭菌，對沙門氏菌和大腸桿菌共培養(yǎng)48 h后，均具有顯著的抑菌能力[10]，而在本研究中，從腸道中分離的丁酸梭菌對大腸桿菌和沙門氏菌也有顯著的抑制作用，但相比于謝樹貴等分離的丁酸梭菌，抑菌效果一般，其原因可能是本試驗分離出的丁酸梭菌對酸抑制更為敏感。

本研究中，從健康土雞腸道分離的乳酸菌和丁

酸梭菌對致病菌均有一定的抑菌效果，其中乳酸菌72 h可完全殺滅致病菌，而丁酸梭菌則會通過阻礙致病菌的生長速度，抑制其快速生長，乳酸菌的抑菌效果明顯強于丁酸梭菌。

后續(xù)研究需探討乳酸菌R5和D2抑菌作用機制和產(chǎn)酶特性研究。

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