ETV4在胃腸道間質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義

徐丹，邱雪杉，2

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院病理科，沈陽 110001；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽 110122）

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤［1］，可發(fā)生C-KIT和血小板衍生生長因子受體α（platelet-derived growth factor receptors-α，PDGFR-α）基因突變［2］。大約10%～30%的GIST發(fā)生轉(zhuǎn)移，是具有惡性潛能的腫瘤［3］。準(zhǔn)確判斷GIST生物學(xué)行為是治療的關(guān)鍵。迄今為止，尚沒有公認(rèn)的生物學(xué)指標(biāo)來判斷其生物學(xué)行為。

ETV4是多瘤促活化因子3（polyoma enhancer activator 3，PEA3）家族成員之一，在細(xì)胞的生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用［4-5］。因此，本研究旨在探討ETV4轉(zhuǎn)錄因子在GIST的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，以及ETV4與C-KIT、PDGFR-α基因突變的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集2012年至2018年2月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科確診為GIST的石蠟標(biāo)本，共91例為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)隨機(jī)選取10例實(shí)驗(yàn)組的癌旁正常胃腸道組織設(shè)為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理及免疫組化確診，免疫組化項(xiàng)目包含Ki67；危險(xiǎn)度分級明確；完整的臨床病歷資料；組織蠟塊材料充足。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理或免疫組化無法確診；危險(xiǎn)度分級不明確；不具有完整的臨床病歷資料；組織蠟塊材料較少。

1.2 試劑及儀器

兔抗人多克隆抗體ETV4（HPA005768）購自美國Sigma公司。兔SP檢測試劑盒（KIT-9710），PBS緩沖液以及DAB顯色液均購于福州邁新生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化：采用免疫組化SP法，測定ETV4在GIST組織中的表達(dá)情況。標(biāo)本石蠟塊切片4 μm厚，在75 ℃恒溫箱中放置4 h，取出后自然冷卻。將切片脫蠟、水合，放置于高壓水浴鍋內(nèi)的枸櫞酸鈉緩沖液中進(jìn)行熱修復(fù)，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，37 ℃靜置30 min后，PBS緩沖液洗片3次，一次5 min，隨后滴加山羊血清封閉液，37 ℃靜置40 min后，滴加ETV4抗體（1 ∶200）切片在4 ℃過夜。復(fù)溫、PBS緩沖液洗片后滴加生物素標(biāo)記的第二抗體，37 ℃靜置30 min，PBS緩沖液洗片3次，一次5 min，隨后滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，37 ℃靜置30 min后，PBS緩沖液洗片后滴加DAB顯色液，自來水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，最后用中性樹膠封片。

1.3.2 基因檢測：用直接測序法對所有病例進(jìn)行C-KIT和PDGFR-α測序，測序由廈門艾德生物有限公司完成。

1.4 GIST術(shù)后危險(xiǎn)度評分標(biāo)準(zhǔn)

2008年4月，美國國立衛(wèi)生研究院（national institutes of health，NIH）重新發(fā)布了關(guān)于原發(fā)可切除GIST的危險(xiǎn)度評分標(biāo)準(zhǔn)。與FLETCHER等［6］提出的相比，增加了原發(fā)腫瘤的部位以及腫瘤破裂作為評判危險(xiǎn)度的指標(biāo)。見表1。

1.5 結(jié)果判定

由2名病理科醫(yī)師在400倍的光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)完整腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性，以陽性細(xì)胞比例得分乘以染色強(qiáng)度得分為最終評判得分。陽性細(xì)胞比例評分：＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分。染色強(qiáng)度評分：未染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，最終得分≤4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），≥9分為強(qiáng)陽性（+++）。

表1 原發(fā)GIST切除后風(fēng)險(xiǎn)分級Tab.1 Proposed modification of the consensus classification for selecting patients with GISTs for adjuvant therapy

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用行×列聯(lián)表的χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman相關(guān)分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GIST中ETV4的表達(dá)情況

在91例GIST組織中，有18例（19.8%）ETV4呈弱陽性表達(dá)，34例（37.4%）ETV4呈中等陽性表達(dá)，39例（42.9%）呈強(qiáng)陽性表達(dá)。見圖1。ETV4在癌旁正常組織中呈弱陽性表達(dá)。

2.2 ETV4在GIST中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 ETV4在GIST中的表達(dá) 免疫組化SP法 ×400Fig.1 ETV4 expression in a gastrointestinal stromal tumor SP ×400

ETV4轉(zhuǎn)錄因子在GIST中的表達(dá)水平與患者的性別，年齡，發(fā)生部位，組織學(xué)類型無關(guān)（P＞ 0.05），而與腫瘤大小、核分裂像、Ki-67增殖指數(shù)有關(guān)（P＜0.05）。GIST最常見的轉(zhuǎn)移部位是肝臟，在本研究中共有8例發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，其中6例在最初診斷時(shí)已有肝轉(zhuǎn)移，ETV4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平與肝轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），ETV4表達(dá)水平越高，患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能也越大。見表2。此外，采用Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，ETV4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平越高，其危險(xiǎn)度越高，并且兩者具有顯著正相關(guān)（r=0.387，P＜ 0.001）。見表3。

2.3 ETV4在突變型和野生型GIST的表達(dá)的相關(guān)性

在91例GIST組織中，11例發(fā)生PDGFR-α基因突變，65例發(fā)生C-KIT基因突變，其中60例發(fā)生外顯子11突變，4例發(fā)生外顯子9突變，1例發(fā)生外顯子13突變，野生型18例，Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)ETV4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平與C-KIT基因突變呈顯著正相關(guān)（r=0.324，P=0.008），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，ETV4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平與突變型GIST也呈顯著正相關(guān)（r=0.325，P=0.005），然而ETV4蛋白表達(dá)水平與PDGFR-α基因突變無關(guān)（P＞ 0.05）。見表3。

3 討論

GIST多見于50歲以上的老年人［1］，最常發(fā)生于胃部（60%～70%），其次為小腸（25%～36%），結(jié)直腸（5%）以及食管（5%）［7］。顯微鏡下大多數(shù)GIST由梭形細(xì)胞組成（70%），少數(shù)由上皮樣細(xì)胞（20%）或混合細(xì)胞型（10%）構(gòu)成。GIST為具有惡性潛能的腫瘤，大約10%～30%的GIST發(fā)生轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為［3］，最常見的轉(zhuǎn)移部位為肝臟（65%），其次為腹膜（21%），也可轉(zhuǎn)移至骨和肺（10%），但極為罕見［8］。因此準(zhǔn)確判斷其生物學(xué)行為是治療GIST的關(guān)鍵。

ETS家族是最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，其亞家族PEA3家族主要參與多種生理過程，如早期發(fā)育，器官發(fā)生和形態(tài)發(fā)生［9］。在胚胎形成時(shí)期，ETV4廣泛表達(dá)于各個(gè)組織，促進(jìn)腎臟、肺、乳腺等上皮源性器官的形態(tài)發(fā)生［4］，然而ETV4很少表達(dá)于成人的正常組織中，主要表達(dá)于乳腺癌，胃癌，前列腺癌，結(jié)腸癌和卵巢癌等腫瘤組織［10］。大量研究［10-14］表明，ETV4在前列腺、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽管癌的高度表達(dá)往往提示預(yù)后不良。在本研究中，ETV4在GIST中呈中強(qiáng)度陽性率為80.2%，并且與腫瘤大小，核分裂像，Ki67增殖指數(shù)，肝轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，ETV4的異常表達(dá)與GIST細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有關(guān)。這與ZENG等［15］的研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)ETV4轉(zhuǎn)錄因子在GIST的表達(dá)水平與腫瘤的危險(xiǎn)度呈顯著相關(guān)，ETV4轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平越高，危險(xiǎn)度越高。因此ETV4轉(zhuǎn)錄因子可與危險(xiǎn)度一起作為臨床判定GIST生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。

表2 GIST患者ETV4在不同病理特征中的表達(dá)Tab.2 ETV4 expression levels in the patients with different clinicopathological features of gastrointestinal stromal tumors

表3 ETV4在GIST的表達(dá)與危險(xiǎn)度、基因突變的相關(guān)性Tab.3 Correlation of ETV4 expression in gastrointestinal stromal tumor to risk rank and gene mutation

此外，本研究還探討ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與野生型，突變型GIST的關(guān)系。C-KIT以及PDGFR-α基因突變是人類患有GIST的主要原因。70%～80%的GIST有C-KIT突變，最常見的是外顯子11突變，而5%～10%GIST存在PDGFR-α突變［16］。對于既沒有C-KIT基因突變，也沒有PDGFR-α基因突變的GIST為野生型GIST［17］。在本研究中，突變型GIST中ETV4呈中強(qiáng)度陽性率為86.3%，并且ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平與突變型GIST顯著相關(guān)，發(fā)生C-KIT基因突變的GIST中ETV4呈中強(qiáng)度陽性率為86.2%，并且ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平與C-KIT基因突變具有顯著相關(guān)，然而ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平與PDGFR-α基因突變無關(guān)。因此，ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平與C-KIT基因有關(guān)。RAN等［18］研究報(bào)道PEA3家族另一成員ETS變異體1通過結(jié)合KIT增強(qiáng)子區(qū)域從而正調(diào)節(jié)KIT的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。大量研究［11，19-20］表明，PEA3家族具有很高的序列同源性以及相似的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，然而調(diào)節(jié)C-KIT表達(dá)的是否是這組同源序列或者DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域目前尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，GIST的生物學(xué)行為除了依靠腫瘤大小，核分裂像來判斷外，ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也可以作為生物學(xué)指標(biāo)，以便綜合性地判斷GIST的生物學(xué)行為，更有助于指導(dǎo)治療。此外，ETV4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，還與C-KIT突變型GIST顯著相關(guān)，為GIST的治療提供新的方向和思路。