免疫組化法和NADPH-d酶組化法在術(shù)中快速診斷嬰幼兒先天性巨結(jié)腸(HD)中應(yīng)用價(jià)值的比較

任智慧, 趙淑君, 阿米娜·哈山, 李鴻巖

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院, 烏魯木齊 830054; 2新疆烏魯木齊市第一人民醫(yī)院病理科, 烏魯木齊, 830011)

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung′s disease，HD)是常見的先天性小兒消化道發(fā)育畸形疾病，主要由于遠(yuǎn)端結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如引起痙攣，使近端結(jié)腸內(nèi)糞便無(wú)法正常通過(guò)而導(dǎo)致擴(kuò)張的腸神經(jīng)節(jié)病變。目前治療方法選擇以外科手術(shù)切除病變腸管作為該病療效確切的唯一治療方法[1]。近年來(lái)不斷進(jìn)步的診斷技術(shù)和圍手術(shù)期處理，尤其是微創(chuàng)技術(shù)的應(yīng)用，使得手術(shù)年齡逐步提前，行根治術(shù)也愈發(fā)安全[2]。盡可能保留正常腸管并徹底切除病變組織在很大程度上是決定手術(shù)成功的關(guān)鍵所在，而這又以術(shù)中科學(xué)準(zhǔn)確的快速冰凍HE染色判斷為前提。因此，針對(duì)現(xiàn)有病理診斷中存在的困難及問(wèn)題，研究并建立一種可操作性強(qiáng)、快捷精準(zhǔn)的病理診斷方法成為HD外科治療中的重中之重。本研究選取烏魯木齊兒童醫(yī)院2016年7月-2018年9月間收治的3個(gè)月以內(nèi)的先天性巨結(jié)腸患兒作為研究對(duì)象，探討免疫組化和還原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADPH-d)酶組織化學(xué)染色法在診斷段嬰幼兒HD中的應(yīng)用價(jià)值，比較分析兩種方法在HD切除術(shù)中病理診斷的各自特點(diǎn)，以期為HD術(shù)中快捷和準(zhǔn)確診斷提供更優(yōu)選擇。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象選擇新疆烏魯木齊兒童醫(yī)院2016年7月-2018年9月間收治的HD患兒，以患兒術(shù)中切除腸管做為研究樣本，所有病例經(jīng)由常規(guī)病理檢查確診為HD。其中男性28例，女性8例，年齡3 d至3個(gè)月，中位年齡2個(gè)月。每個(gè)腸管分?jǐn)U張段、痙攣段取材，分次置-80℃冰箱冷凍保存，陽(yáng)性對(duì)照為結(jié)腸造瘺術(shù)患兒的切除腸管標(biāo)本，分免疫組化、NADPH-d染色法兩組。

1.2 制片對(duì)標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)冰凍連續(xù)切片，片厚4 ～5 μm，分別做免疫組化、NADPH-d染色。

1.3 快速免疫組化冰凍切片空氣干燥30 s，丙酮固定1 min，3% 過(guò)氧化氫3 min，洗滌緩沖液(TBST，PH7.6)洗10 s，滴加1∶100 稀釋一抗組織蛋白酶D (CAD，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)置于恒溫箱內(nèi)孵育10 min；TBST沖洗10 s，滴加二抗(邁新生物技術(shù)有限公司)37℃孵育5 min，TBST 沖洗1 0 s, 高敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)37℃顯色1～3 min至顯微鏡觀察最適合陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，流水洗30 s，蘇木素復(fù)染15 s，42℃水洗30 s，脫水、透明后中性樹膠封片。陽(yáng)性對(duì)照：對(duì)結(jié)腸造瘺切除標(biāo)本同時(shí)切片并分別染色，陰性對(duì)照一抗滴加TBST。

1.4 NADPH-d的酶組織學(xué)染色方法反應(yīng)液組成將0.5 mg NADPH-d(Sigma)、10 μL二甲基亞砜(MP Biomedicals, LLC)、0.6 mg NBT(Sigma)、3 μL Triton x-100(Solarbio)依次加入1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH 8.0)并混勻。把反應(yīng)液滴在冰凍切片上樣本處后，將載玻片放置于孵育盒內(nèi)，于30℃恒溫10 min，觀察反應(yīng)液由黃色變微紫后即可取出。顯微鏡下觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞清晰可見，即可用PBS洗液終止反應(yīng)并封片。陽(yáng)性對(duì)照：對(duì)結(jié)腸造瘺切除標(biāo)本同時(shí)切片并分別染色，陰性對(duì)照：反應(yīng)液中不加入NADPH-d。

1.5 雙重染色NADPH-d的酶組織學(xué)染色后采集圖像，再行冰凍切片HE染色，觀察神經(jīng)叢所在位置，再次采集圖像，存檔后對(duì)比觀察。

1.6 結(jié)果觀察免疫組化CAD染色陽(yáng)性時(shí)即在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)中顯示棕黃色顆粒；NADPH-d酶組織學(xué)染色陽(yáng)性時(shí)則神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)藍(lán)色、胞核不著色；同時(shí)對(duì)擴(kuò)張段肌間及黏膜下神經(jīng)叢染色情況、痙攣段的神經(jīng)叢的染色程度進(jìn)行觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較組間兩種不同染色，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)張段快速免疫組化經(jīng)一抗CAD染色后，35例腸壁肌間與黏膜下層神經(jīng)叢中可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒(見圖1)，診斷時(shí)間共耗時(shí)22～25 min；NADPH-d酶組織學(xué)染色，滴加反應(yīng)液孵育8～10 min后，于低倍鏡下可觀察到35例樣本的神經(jīng)叢結(jié)構(gòu)呈串珠狀分布(見圖2a)，高倍鏡下可觀察到胞核無(wú)著色，胞質(zhì)著藍(lán)色的細(xì)胞(見圖2b)；以HE對(duì)NADPH-d的酶組織學(xué)染色后的切片進(jìn)行復(fù)染，證實(shí)串珠狀分布的藍(lán)色組織為肌間神經(jīng)叢，高倍鏡下可清楚分辨核大、深染、胞質(zhì)略呈嗜堿性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(見圖3)。

2.2 痙攣段腸壁神經(jīng)叢內(nèi)未觀察到CAD陽(yáng)性染色神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或神經(jīng)纖維(見圖4)；NADPH-d酶組織學(xué)染色，鏡下見背景清晰無(wú)著色，未見神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(見圖5)。

2.3 陽(yáng)性對(duì)照組織免疫組化、NADPH-d染色和HE染色同HD擴(kuò)張段。

2.4 NADPH-d染色和CAD染色各組中的陽(yáng)性表達(dá)36例患兒中，NADPH-d染色診斷陽(yáng)性35例(97.2%)，陰性1例(2.8%)；CAD染色診斷陽(yáng)性35例(97.2%)，陰性1例(2.8%)；兩種染色方法均診斷陽(yáng)性和陰性分別為34例和1例；兩種染色方法的診斷結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.029，P=0.972)。結(jié)果見表1。

a： IHC染色 ×10) b： IHC染色 ×20)

a： NADPH-d染色 ×100) b： NADPH-d染色 ×200)

NADPH-d染色 ×100)

a： IHC染色 ×10) b： IHC染色 ×20)

NADPH-d染色 ×200)

表1 HD患兒腸管標(biāo)本NADPH-d酶組織化學(xué)染色與CAD染色診斷結(jié)果比較

3 討論

先天性巨結(jié)腸(HD)是一種發(fā)病率約為1/5 000的腸神經(jīng)元發(fā)育異常的常見疾病，其中亞洲人種發(fā)病率最高，為2.8/10 000[3]，HD屬于嚴(yán)重的出生缺陷，其預(yù)后差，而且30% 的患兒合并多種其他畸形( 如先心病、 中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常、 眼科疾病、 泌尿畸形等) ，嚴(yán)重危害新生兒的生命健康，以上現(xiàn)狀高度提示加強(qiáng)對(duì)HD疾病的排查確診和評(píng)估的重要性[4-5]。對(duì)于HD導(dǎo)致的腸梗阻首選手術(shù)治療，3個(gè)月以內(nèi)手術(shù)者稱為巨結(jié)腸的早期治療[6]，而術(shù)中主要依據(jù)術(shù)中快速病理診斷確定切除病變腸管的長(zhǎng)度。先天性巨結(jié)腸的病理診斷依據(jù)是遠(yuǎn)端病變腸壁肌間與黏膜下層神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如。由于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育是一個(gè)逐漸成熟的過(guò)程，期間多種因素影響可導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育不成熟甚至完全未發(fā)育[7]，這種發(fā)育不成熟的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在嬰幼兒期相對(duì)更常見，這種未成熟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在術(shù)中冰凍切片HE染色中不易被觀察到，對(duì)確定病變腸管切緣易造成風(fēng)險(xiǎn)。

CAD是一種天冬氨酸蛋白酶，較多分布在人類神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、腦組織神經(jīng)元中，其可作為腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的標(biāo)記物。在結(jié)腸腸壁神經(jīng)組織中，CAD的免疫反應(yīng)性僅局限于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在神經(jīng)纖維和神經(jīng)鞘膜細(xì)胞均不表達(dá)。在本研究結(jié)果中，CAD染色陽(yáng)性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在35例嬰幼兒擴(kuò)張段腸壁神經(jīng)叢內(nèi)均可見，而在36例HD嬰幼兒痙攣狹窄段腸壁神經(jīng)叢內(nèi)均未見表達(dá)，其數(shù)量和染色深淺不一，這說(shuō)明CAD對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不僅具有較高的特異性表達(dá)，而且對(duì)區(qū)分不同成熟程度的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有一定的輔助作用。其中部分病例CAD染色陽(yáng)性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布稀疏，是否合并巨結(jié)腸同源病有待進(jìn)一步研究。本免疫組化實(shí)驗(yàn)及診斷共耗時(shí)22～25 min，比徐紅艷等[8]報(bào)道的時(shí)間長(zhǎng)，原因有待研究。

NADPH-d能準(zhǔn)確標(biāo)記一氧化氮合酶，后者釋放的內(nèi)源性一氧化氮通過(guò)腸神經(jīng)系統(tǒng)使腸管擴(kuò)張[9]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者以NADPH-d酶組織化學(xué)方法研究先天性巨結(jié)腸患者有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸管中一氧化氮合酶的分布，并取得了很好的效果[ 10-11]，尤其是對(duì)新生兒期HD。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)對(duì)本組36例嬰幼兒HD腸壁的NADPH-d染色后，35例HD擴(kuò)張段腸壁肌間神經(jīng)叢內(nèi)均可見清晰的胞質(zhì)呈藍(lán)色、核空白的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，36例HD痙攣段組腸壁神經(jīng)叢鏡下背景干凈，無(wú)任何著色，缺乏陽(yáng)性表達(dá)，未見神經(jīng)叢及陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，與擴(kuò)張段形成強(qiáng)烈反差。 本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)痙攣段是由于缺乏一氧化氮合酶使腸管無(wú)法擴(kuò)張而引起痙攣，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)痙攣段黏膜下層未見陽(yáng)性神經(jīng)叢，與現(xiàn)有的研究結(jié)果一致[11]，其原因有待進(jìn)一步研究。在兩種染色實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)張段均有1例未觀察到CAD、NADPH-d陽(yáng)性的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，經(jīng)復(fù)查病例，證實(shí)該患兒為全結(jié)腸型HD。

盡管免疫組化、NADPH-d染色陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NADPH-d酶組織學(xué)染色與免疫組化相比，其最大優(yōu)勢(shì)在于診斷時(shí)間短且陽(yáng)性結(jié)果易識(shí)別，結(jié)果讀取直觀。因此筆者認(rèn)為NADPH-d酶組織化學(xué)染色法更適用于術(shù)中快速診斷嬰幼兒HD，結(jié)合術(shù)中快速HE染色法可以更好地提高HD的診斷準(zhǔn)確率，以便精準(zhǔn)地確定病變腸管的切除范圍，進(jìn)一步降低復(fù)發(fā)率并減少術(shù)后不良反應(yīng)。術(shù)中快速免疫組化CAD染色對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞成熟度的判斷有一定幫助，但對(duì)抗體要求高，實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，診斷時(shí)間長(zhǎng)，這對(duì)于快速診斷HD有一定限制，不宜廣泛推廣。