基于p38絲裂原活化蛋白激酶通路的胰高血糖素樣肽-1對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制

張軍艷，樊玉香，栗延偉，朱紅燦

急性腦梗死是臨床常見的腦血管疾病。隨著近年來肥胖、高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病的增多，本病的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢(shì)。早期再灌注治療能夠及時(shí)再通閉塞血管、恢復(fù)缺血腦組織血流灌注，進(jìn)而減輕缺血缺氧對(duì)神經(jīng)功能的損害[1-3]。但是，腦組織在經(jīng)歷缺血再灌注(I/R)的過程中，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路過度激活所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)加劇神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而加重腦組織的損傷，該過程又被稱為I/R損傷[4-5]。因此，抑制p38MAPK通路所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)是減輕I/R損傷、改善急性腦梗死再灌注治療效果的潛在靶點(diǎn)。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是由腸道L細(xì)胞分泌的具有降糖活性的多肽。利拉魯肽是GLP-1類似物，目前被用于2型糖尿病患者的降糖治療。近年來GLP-1生物學(xué)活性研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1不僅具有降糖作用，還能在多種組織和細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用[6-7]。動(dòng)物研究證實(shí)，GLP-1類似物利拉魯肽能夠減輕高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元炎癥及氧化應(yīng)激損傷，提示利拉魯肽對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用[8]。基于此，本研究將GLP-1類似物利拉魯肽用于大鼠腦缺血再灌注損傷的干預(yù)，從p38MAPK通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激分析利拉魯肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)別的雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，購買于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005。將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、GLP-1組、p38MAPK抑制劑組，每組12只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 利拉魯肽注射液購自諾和諾德公司，p38MAPK抑制劑SB2020190購自Sigma公司，p38、JNK、ERK1/2的單克隆抗體購自Abcam公司，ELISA試劑盒購自上海西唐公司，活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)檢測(cè)試劑盒購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 模型組、GLP-1組、p38MAPK抑制劑組按照下列方法建立腦I/R損傷模型：大鼠用10%水合氯醛麻醉后擺放仰臥位，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)后做頸正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈分叉處結(jié)扎，頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處繞線但暫不結(jié)扎。在繞線遠(yuǎn)端做一小切口，將尼龍線栓插入至大腦中動(dòng)脈，栓線的血管外部分結(jié)扎固定，缺血2 h后取出線栓完成再灌注。假手術(shù)組按照相同的方法進(jìn)行麻醉及頸動(dòng)脈血管分離的操作，但不插入線栓。

1.2.2 給藥方法 GLP-1組大鼠在再灌注前30 min給予利拉魯肽皮下注射(70 μg/kg)，再灌注后每天給予70 μg/kg的利拉魯肽皮下注射，連續(xù)7 d。p38MAPK抑制劑組在再灌注前30 min時(shí)將5 μl濃度為10 μmol/L的SB202190溶液注入側(cè)腦室。假手術(shù)組和模型組按照與利拉魯肽相同的劑量注射生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.2.3 水迷宮測(cè)試方法 各組大鼠于干預(yù)后第1～6 d進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，第7 d進(jìn)行定位巡航和空間探索測(cè)驗(yàn)。水迷宮直徑160 cm、高度55 cm、水深30 cm，平臺(tái)直徑12 cm、高28 cm。訓(xùn)練時(shí)，分別將大鼠從4個(gè)象限放入水中，如大鼠在90 s內(nèi)爬上平臺(tái)并停留3 s以上則認(rèn)為找到平臺(tái)，并記錄逃避潛伏期；如大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則拖拽其尾部引導(dǎo)至平臺(tái)并記錄逃避潛伏期為90 s，每次訓(xùn)練間隔為5 min。第7 d進(jìn)行定位巡航測(cè)定，記錄大鼠從四個(gè)象限找到平臺(tái)的平均逃避潛伏期；撤除平臺(tái)后記錄大鼠在90 s內(nèi)穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.2.4 腦梗死體積測(cè)定方法 完成行為學(xué)評(píng)價(jià)后過量麻醉處死大鼠，取每組取一半大鼠用于腦梗死體積測(cè)定，解剖完整的腦組織后迅速進(jìn)行冰凍切片，每張厚度5 mm，放置在2%的TTC溶液內(nèi)、37 ℃染色20 min，4%多聚甲醛固定后拍照記錄。用Image J軟件計(jì)算各個(gè)切片的腦組織面積及腦梗死面積，按照腦梗死面積/腦組織面積計(jì)算腦梗死體積。

1.2.5 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法 取組內(nèi)另一半處死的大鼠，解剖I/R部位的腦組織并等分為兩份。其中一份用石蠟包埋后制作石蠟切片，用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色后在熒光顯微鏡的高倍視野下觀察，計(jì)數(shù)TUNEL陽性染色細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)數(shù)目及DAPI陽性染色細(xì)胞(總細(xì)胞)數(shù)目，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 蛋白表達(dá)的Western-blotting檢測(cè) 取另一半I/R部位腦組織，加入蛋白裂解液后提取總蛋白。對(duì)總蛋白進(jìn)行定量后，取50 μg總蛋白加入預(yù)先配置好的SDS-聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣孔內(nèi)，進(jìn)行垂直電泳后將蛋白樣本電轉(zhuǎn)膜至NC膜。NC膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h后在4 ℃中孵育p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2的單克隆抗體過夜。第2 d取出NC膜，孵育辣根過氧化物酶第二抗體1 h，最后加入顯影液并在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶。用Image J軟件掃描蛋白條帶灰度值，計(jì)算p-p38與p38、p-JNK與JNK、p-ERK1/2與ERK1/2灰度值的比值，以此作為蛋白的表達(dá)水平。

1.2.7 細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 取蛋白裂解液提取得的總蛋白樣本，采用ELISA試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。采用ROS試劑盒測(cè)定ROS水平，采用MDA試劑盒測(cè)定MDA水平，采用SOD試劑盒測(cè)定SOD水平，采用GPx測(cè)定GPx水平。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析、兩兩比較采用LNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組間腦梗死體積的比較 見圖1。假手術(shù)組、模型組、GLP-1組、p38MAPK抑制劑組腦梗死體積分別為0%、(48.59±7.68)%、(14.42±3.28)%、(23.57±4.58)%。與模型組比較，GLP-1組和p38MAPK抑制劑組大鼠的腦梗死體積顯著降低(均P<0.05)。

圖1 大鼠腦梗死病灶的TCC染色圖

2.2 各組水迷宮參數(shù)的比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(均P<0.05)。與模型組比較，GLP-1組和p38MAPK抑制劑組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增多(均P<0.05)。

2.3 各組梗死腦組織細(xì)胞凋亡率的比較 見圖2。假手術(shù)組、模型組、GLP-1組、p38MAPK抑制劑組梗死腦組織細(xì)胞凋亡率分別為(4.73±0.84)%、(35.37±6.78)%、(11.38±1.84)%、(13.94±2.26)%。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死腦組織中的細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)。與模型組比較，GLP-1組和p38MAPK抑制劑組大鼠梗死腦組織中的細(xì)胞凋亡率明顯減少(均P<0.05)。

2.4 各組梗死腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死腦組織中MDA、ROS水平明顯增多，SOD、GPx水平明顯減少(均P<0.05)。與模型組比較，GLP-1組和p38MAPK抑制劑組大鼠梗死腦組織中MDA、ROS水平明顯減少，SOD、GPx水平明顯增多(均P<0.05)。

表1 各組逃避潛伏期及穿越平臺(tái)次數(shù)的比較(x±s,n=12)組別逃避潛伏期(s)穿越平臺(tái)次數(shù)(次)假手術(shù)組22.31±3.2813.41±1.98模型組52.37±8.79*5.67±0.83*GLP-1組37.64±6.72△8.94±1.26△p38MAPK抑制劑組38.12±6.88△8.42±1.09△ 注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05

圖2 各組間梗死腦組織細(xì)胞凋亡(TUNEL染色，×400)

表2 各組梗死腦組織MDA、ROS、SOD、GPx的比較(x±s,n=6)組別MDA(μmol/L)ROS(μmol/L)SOD(U/L)GPx(U/L)假手術(shù)組1.03±0.170.74±0.12132.38±18.5976.68±11.38模型組9.58±1.32*5.47±0.88*46.78±8.42*30.42±6.85*△GLP-1組3.41±0.58△1.89±0.23△91.38±11.38△58.68±8.38△p38MAPK抑制劑組3.68±0.62△2.11±0.35△88.41±10.94△56.23±7.47△ 注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05

2.5 四組間梗死腦組織中炎癥指標(biāo)的比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，GLP-1組和p38MAPK抑制劑組大鼠梗死腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯減少(均P<0.05)。

2.6 各組梗死腦組織p38MAPK通路分子表達(dá)的比較 見圖3、表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠梗死腦組織中p-p38的表達(dá)水平明顯增多(P<0.05)，p-ERK1/2、p-JNK的表達(dá)水平無明顯變化(均P>0.05)；與模型組比較，GLP-1組和p38MAPK抑制劑組大鼠梗死腦組織中p-p38的表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)，p-ERK1/2、p-JNK的表達(dá)水平無明顯變化(均P>0.05)。

表3 各組梗死腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6的比較(x±s,n=6,ng/ml)組別TNF-αIL-1βIL-6假手術(shù)組3.29±0.861.34±0.186.59±0.89模型組14.52±2.23*8.49±1.32*21.35±3.42*GLP-1組5.47±0.83△2.88±0.42△11.32±1.85△p38MAPK抑制劑組6.03±0.91△3.10±0.47△12.14±2.08△ 注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05

圖3 各組梗死腦組織中p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白電泳圖 A：p-p38蛋白電泳圖；B：p-ERK1/2蛋白電泳圖；C：p-JNK蛋白電泳圖

表4 各組梗死腦組織p-p38、p-ERK1/2、p-JNK表達(dá)的比較(x±s,n=6)組別p-p38p-ERK1/2p-JNK假手術(shù)組1.00±0.181.00±0.231.00±0.18模型組2.31±0.52*1.07±0.21*1.18±0.24*GLP-1組1.65±0.32△1.14±0.31△1.06±0.26△p38MAPK抑制劑組1.77±0.38△1.01±0.25△0.99±0.22△ 注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05

3 討 論

I/R是急性腦梗死再灌注治療后必經(jīng)的病理生理過程，I/R過程中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的激活能夠引起組織I/R損傷并影響再灌注治療效果。近年來，如何減輕腦I/R損傷受到了越來越多的關(guān)注。GLP-1是具有降糖、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性的生物多肽[9]。利拉魯肽作為GLP-1類似物已在高同型半胱氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷模型中被證實(shí)能夠減輕神經(jīng)元的炎癥及氧化應(yīng)激損傷[8]，但關(guān)于GLP-1在腦I/R損傷中所起的作用仍未見明確報(bào)道。本研究通過大腦中動(dòng)脈栓塞及再灌注建立了大鼠腦I/R模型，再灌注后7 d觀察到模型組大鼠腦組織存在明顯的梗死病灶，且水迷宮試驗(yàn)中逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)均發(fā)生了明顯變化，提示大鼠腦I/R模型存在明顯的大體形態(tài)改變及神經(jīng)行為改變，發(fā)生了I/R損傷。在再灌注前30 min及再灌注后7 d連續(xù)給予GLP-1類似物干預(yù)發(fā)現(xiàn)，GLP-1組大鼠的腦梗死體積明顯小于模型組，且水迷宮參數(shù)逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)均優(yōu)于模型組，提示GLP-1干預(yù)能夠減輕大鼠腦I/R損傷。

腦I/R損傷過程涉及細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中細(xì)胞凋亡是多種生物學(xué)環(huán)節(jié)共同作用的下游機(jī)制，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均能激活細(xì)胞凋亡并引起組織損傷[10-11]。本研究通過TUNEL染色明確大鼠腦I/R損傷過程中細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果顯示，模型組大鼠梗死腦組織中的細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組，提示腦I/R過程中發(fā)生了過度的細(xì)胞凋亡。在使用GLP-1類似物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，GLP-1組大鼠梗死腦組織中的細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，說明GLP-1能夠減輕大鼠腦I/R過程中的細(xì)胞凋亡。GLP-1減輕腦I/R過程中細(xì)胞凋亡的效應(yīng)與GLP-1減輕I/R損傷程度的效應(yīng)相一致，也提示減輕細(xì)胞凋亡可能是GLP-1減輕大鼠腦I/R損傷程度的機(jī)制。

氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是I/R過程中重要的病理變化，該過程中氧自由基及炎癥介質(zhì)的大量產(chǎn)生不僅能夠直接破壞神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)，也能通過下游caspase介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)來引起細(xì)胞凋亡。ROS是氧化應(yīng)激過程中最重要的氧自由基，與神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)反應(yīng)后造成細(xì)胞損傷，增加MDA釋放及SOD、GPx消耗[12-13]；TNF-α、IL-1β、IL-6是炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮促炎作用的炎癥介質(zhì)，能夠介導(dǎo)炎癥的級(jí)聯(lián)放大[14-15]。本研究對(duì)大鼠腦I/R損傷過程中氧化應(yīng)激介質(zhì)及炎癥細(xì)胞因子的分析顯示，模型組大鼠梗死腦組織中ROS、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于假手術(shù)組，SOD和GPx水平明顯低于假手術(shù)組，提示腦I/R過程存在明顯的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)激活。GLP-1類似物已經(jīng)在高同型半胱氨酸誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷模型中被證實(shí)具有抗炎及抗氧化作用。本研究在GLP-1干預(yù)后分析I/R腦組織中氧化應(yīng)激及炎癥的變化可知：GLP-1組大鼠梗死腦組織中ROS、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯低于模型組，SOD和GPx水平明顯高于模型組，提示GLP-1能夠減少腦I/R損傷過程中氧自由基及炎癥介質(zhì)的釋放，具有抗炎及抗氧化作用。

p38MAPK信號(hào)通路是目前已知調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的重要通路。該通路包括p38、JNK、ERK1/2等重要的信號(hào)分子，三種不同的信號(hào)分子能夠通過自身磷酸化的激活來介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)的級(jí)聯(lián)放大傳遞，最終造成細(xì)胞內(nèi)氧自由基及炎癥介質(zhì)的改變[16]。本研究對(duì)大鼠腦I/R過程中p38MAPK信號(hào)通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠梗死腦組織中p-p38的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組、GLP-1類似物干預(yù)后大鼠梗死腦組織中p-p38的表達(dá)水平明顯低于模型組，而三組間p-JNK、p-ERK1/2的表達(dá)水平無明顯差異，提示p38MAPK通路中p38信號(hào)分子的磷酸化活化在腦I/R損傷中發(fā)揮重要作用，GLP-1類似物能夠明顯抑制I/R過程中p38的磷酸化。為了進(jìn)一步驗(yàn)證p38信號(hào)分子受抑制在腦I/R損傷過程中所起到的保護(hù)作用，本研究在再灌注前將p38的抑制劑SB202190注入側(cè)腦室，結(jié)果顯示，p38MAPK抑制劑組大鼠的腦梗死體積明顯小于模型組，水迷宮參數(shù)優(yōu)于模型組，梗死腦組織中的細(xì)胞凋亡率及ROS、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯低于模型組，SOD和GPx的含量明顯高于模型組，提示抑制I/R過程中p38的磷酸化活化能夠減輕大鼠腦I/R損傷及I/R過程中的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，大鼠腦I/R過程中p38介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥明顯激活，GLP-1能夠通過抑制p38介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)來減輕大鼠腦I/R損傷。