貴州省黔南地區(qū)豬源腸球菌的分離鑒定及其耐藥性分析

羅致茜 ， 呂世明 ， 譚艾娟 ， 董保豫 ， 猶銀俊 ， 林 習(xí) ， 楊睿智 ， 鄭汝青 ， 周 玲

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽(yáng) 550025 ； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽(yáng) 550025 ； 3.黔南州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 貴州 都勻 558000)

腸球菌(Enterococcus)屬腸球菌屬，為革蘭陽(yáng)性球菌，廣泛分布于環(huán)境及人和動(dòng)物腸道內(nèi)，是人類(lèi)和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分。腸球菌為條件致病菌，在正常條件下不致病，但是隨著畜牧業(yè)中免疫抑制劑及抗菌藥物的廣泛使用，腸球菌已成為重要的條件致病菌，臨床腸球菌所致感染性疾病逐年增多[1-2]，感染發(fā)生率正在逐年上升，可引起泌尿道感染、敗血癥及心內(nèi)膜炎等多種疾病。據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)中多藥耐藥的腸球菌在臨床已并不少見(jiàn)[3-5]。大量的抗菌藥物用于動(dòng)物疾病的預(yù)防與治療，對(duì)細(xì)菌的耐藥性產(chǎn)生巨大的選擇壓力，養(yǎng)殖場(chǎng)已經(jīng)成為耐藥菌產(chǎn)生的主要地方之一，并且腸球菌存在通過(guò)食物鏈傳播并轉(zhuǎn)移耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)[6]。我國(guó)獸醫(yī)臨床上已經(jīng)在雞、鴨、綿羊、仔豬等動(dòng)物中分離出腸球菌，由此可見(jiàn)動(dòng)物源腸球菌耐藥的現(xiàn)狀形勢(shì)嚴(yán)峻，有必要對(duì)其耐藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，及時(shí)分析動(dòng)物源腸球菌的耐藥性，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)中腸球菌的臨床抗菌藥物的用藥具有指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)針對(duì)貴州省黔南地區(qū)部分豬場(chǎng)分離的腸球菌的耐藥性進(jìn)行研究，為貴州省腸球菌的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2019年1月采集于貴州省黔南地區(qū)10個(gè)豬場(chǎng)共219份肛門(mén)拭子樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基、腸球菌肉湯、腸球菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA Marker 2 000，購(gòu)自天根生化科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；甘油、Gold view Ⅰ型核酸染料，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自西班牙Sigma公司；50×TAE緩沖液，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要藥品 青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、紅霉素、克林霉素、替米考星、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、金霉素，均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備 LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；ST16R高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher公司)；細(xì)菌濁度儀WGZ-XT(杭州齊威儀器有限公司)；T20型雙槽梯度PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；電泳儀JY600(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc XR(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 采樣 將豬肛門(mén)拭子置于滅菌的Cary-Blair氏運(yùn)送培養(yǎng)基，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 預(yù)增菌 將一次性采樣豬肛門(mén)棉拭子取出，置于滅菌裝有腸球菌肉湯的2 mL EP管中，37 ℃培養(yǎng)16～20 h。

1.2.3 腸球菌顯色培養(yǎng)基分離 取預(yù)增菌液一環(huán)，劃線(xiàn)于腸球菌顯色培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取單個(gè)紫色可疑菌落劃線(xiàn)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行純化，然后制成25%甘油菌保種。

1.2.4 鑒定 參照王熙楚等[7]對(duì)腸球菌的分子鑒定方法，腸球菌屬的高度保守的tuf基因組片段的特異性引物序列：上游：5′-TACTGACAAACCATTCATGATG-3′；下游：5′-AATTCGTCACCAACGCGAAC-3′，引物由賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司合成。

細(xì)菌DNA模板制備：參照孫碩[8]采用煮沸法提取細(xì)菌DNA作為模板。

PCR擴(kuò)增：15 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O 5.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含核酸染料)100 V電壓下電泳40 min后成像檢測(cè)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[9]推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定，并按照2013年CLSI發(fā)布的獸醫(yī)藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)—《動(dòng)物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片法和稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(VET01-A4)》和附表(VET01-S2)[10]進(jìn)行結(jié)果判斷，其中慶大霉素按CLSI規(guī)定的高水平耐氨基糖苷類(lèi)耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌為腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29212。

2 結(jié)果

2.1 腸球菌的分離鑒定 從10個(gè)豬場(chǎng)采集的219份肛門(mén)拭子，經(jīng)增菌、純化、鑒定，共分離出132株腸球菌，分離率60.27%。腸球菌在腸球菌顯色培養(yǎng)基上的典型菌落為紫色，其他菌顯無(wú)色、黃色。PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 貴州省黔南地區(qū)豬源腸球菌PCR鑒定結(jié)果

2.2 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表1，132株腸球菌對(duì)青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、苯唑西林、慶大霉素、多西環(huán)素、氧氟沙星、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、氟苯尼考、紅霉素、克林霉素、替米考星、利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、金霉素共17種抗菌藥物敏感性有較大差異，其中對(duì)克林霉素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、紅霉素耐藥最嚴(yán)重，耐藥率為100%；對(duì)頭孢西丁、頭孢噻呋、替米考星、苯唑西林、多西環(huán)素、金霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、青霉素、利奈唑胺、阿莫西林、慶大霉素耐藥率分別為99.24%、99.24%、99.24%、97.73%、96.97%、94.70%、84.09%、83.33%、73.47%、69.70%、63.64%、34.09%；對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率最低(30.30%)。

結(jié)果顯示，對(duì)磺胺類(lèi)(磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(紅霉素)、林可霉素類(lèi)(克林霉素)的耐藥率均為100%；有84株腸球菌對(duì)3種β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物(青霉素、阿莫西林、苯唑西林)均耐藥，耐藥率為63.64%；第2代頭孢(頭孢西丁)與第3代頭孢(頭孢噻呋)的耐藥率均為99.24%；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(紅霉素、替米考星)與四環(huán)素類(lèi)(多西環(huán)素、金霉素)的耐藥率相差不大。

表1 黔南地區(qū)132株豬源腸球菌對(duì)17種抗菌藥物的耐藥性結(jié)果

2.3 腸球菌多重耐藥譜 對(duì)臨床分離的132株腸球菌進(jìn)行多重耐藥分析，如圖2所示，所有菌株均為多重耐藥菌 (multidrug-resistant organisma，MDROs)，多重耐藥譜以耐17種和15種藥物為主，分別達(dá)30.30%(40株)和29.55%(39株)，至少都對(duì)4種藥物耐藥。

3 討論

抗菌藥物的過(guò)度使用是腸球菌耐藥性增加的重要因素。腸球菌因細(xì)胞壁厚，對(duì)有些抗菌藥物天然耐藥，且容易獲得性耐藥，耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)峻。近些年來(lái)，因?yàn)槟退幘瓴粩嘣龆嘁约靶滦湍退幘甑某霈F(xiàn)，使得臨床對(duì)腸球菌預(yù)防與治療變得更加棘手[11]。

圖2 豬源腸球菌的多重耐藥菌株

本試驗(yàn)分離的132株腸球菌對(duì)克林霉素、磺胺異噁唑、紅霉素、復(fù)方新諾明4種藥物耐藥最嚴(yán)重，耐藥率均為100%，臨床不建議使用；對(duì)頭孢西丁、頭孢噻呋、替米考星、苯唑西林、多西環(huán)素、金霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、青霉素、利奈唑胺、阿莫西林、慶大霉素耐藥率依次降低；對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率最低為30.30%。與河南省、江蘇省、銀川等部分地區(qū)[12-14]相比，耐藥率均升高，表明不同地區(qū)腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性程度不同，卻也有上升的趨勢(shì)。

利奈唑胺與萬(wàn)古霉素在獸醫(yī)臨床上都禁止使用，利奈唑胺是第1個(gè)噁唑烷酮類(lèi)抗菌藥，2000年在美國(guó)首次上市，2007年于我國(guó)正式上市，人醫(yī)上主要用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌等[15]。對(duì)于獸醫(yī)臨床不使用的利奈唑胺與萬(wàn)古霉素，在本試驗(yàn)中，利奈唑胺的耐藥率為69.70%，萬(wàn)古霉素耐藥率為30.30%。國(guó)內(nèi)已有報(bào)道表明，豬源分離糞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素存在一定程度的耐藥率。楊龍斌等[16]對(duì)江淮地區(qū)分離的40株豬源腸球菌的耐藥性分析表明，其對(duì)萬(wàn)古霉素敏感率達(dá)72.0%以上。錢(qián)曉璐等[17]對(duì)豬源分離糞腸球菌的耐藥性分析表明，40株糞腸球菌中有4株對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥，其中2株表現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素高度耐藥。顧欣等[18]對(duì)10個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)分離的133株糞腸球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，表明分離菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率為3.01%。王送林等[19]對(duì)湖南豬源糞腸球菌的耐藥性分析表明，42株分離糞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率高達(dá)31%。萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌(Vancomycin-resistant enterococcus，VRE)對(duì)人類(lèi)生命的威脅在逐年增加，根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，養(yǎng)殖場(chǎng)耐萬(wàn)古霉素的腸球菌的產(chǎn)生和傳播不容忽視，且萬(wàn)古霉素的耐藥水平較高，應(yīng)避免使用。

近年來(lái)，由于養(yǎng)殖場(chǎng)臨床抗生素的大量使用，腸球菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，高水平氨基糖苷類(lèi)耐藥菌株(HLAR)、萬(wàn)古霉素耐藥菌株(VRE)以及多重耐藥菌株(MDROs)的出現(xiàn)，給臨床治療帶來(lái)很大的困難和挑戰(zhàn)，應(yīng)充分了解和掌握腸球菌的耐藥情況，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果制訂相應(yīng)的給藥方案，合理使用抗菌藥物，從而減少腸球菌耐藥菌株的產(chǎn)生，對(duì)控制腸球菌傳播具有重要意義。