5種布魯氏菌病競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的比較

虞一聰 ， 桂平雄 ， 倪柏鋒 ， 王雅婷 ， 董建斐 ， 周 蕾 ， 柴 娟 ， 謝榮輝 ， 趙靈燕 ， 徐 輝

(浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 浙江 杭州 311199)

布魯氏菌病(Brucellosis,簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起牛、羊、豬、鹿、犬等哺乳動(dòng)物和人類(lèi)均可感染的一種人獸共患傳染病[1]。家畜感染后母畜常發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等，公畜引起睪丸炎和附睪炎，導(dǎo)致繁殖能力和生產(chǎn)能力下降，并影響畜產(chǎn)品的質(zhì)量和安全[2]。世界上170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)先后發(fā)生人獸布病疫情[3]。20世紀(jì)50年代布病曾在我國(guó)廣泛流行，疫情嚴(yán)重地區(qū)人畜感染率達(dá)50%。20世紀(jì)80—90年代，由于防控力度加大，疫情降至歷史最低水平。自2000年以后，人獸共患布病疫情呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，對(duì)畜牧業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[4]。動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)(GB/T 18646)在更新至2018年版后，增加競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)作為血清學(xué)確診試驗(yàn)。因試管凝集試驗(yàn)(SAT)操作繁瑣、耗時(shí)，cELISA較SAT具有更高的特異性，且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判定客觀。為此，作者以SAT作為參照方法，選擇5個(gè)廠家cELISA試劑盒進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析評(píng)價(jià)各試劑盒的檢測(cè)性能，為本實(shí)驗(yàn)室選擇診斷用試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1 血清 試驗(yàn)血清選取背景清楚的血清共166份，其中牛血清111份，羊血清43份，豬血清12份，均于浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。

1.2 試劑盒 5種布魯氏菌病抗體cELISA試劑盒，分別為A試劑盒(批號(hào)：18121701)、B試劑盒(批號(hào)：181120)、C試劑盒(批號(hào)：020161903)、D試劑盒(批號(hào)：20190619)、E試劑盒(批號(hào)：110718)，分別購(gòu)自國(guó)內(nèi)外5家公司。試管凝集試驗(yàn)陰、陽(yáng)性血清和抗原，均購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(Tecan Infinite F50)，洗板機(jī)(Tecan Hydro Speed)，恒溫箱(BINDER KB115)，離心機(jī)(Eppendorf 5424)，移液槍(Eppendorf)，微量振蕩器(海門(mén)其林貝爾MH-2)，生物安全柜(Thermo 1300 SERIES A2)，高壓滅菌器(TOMY SX-700)。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 SAT 按動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)(GB/T 18646-2018)進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

1.4.2 cELISA 嚴(yán)格按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并按要求判定結(jié)果，平行檢測(cè)所有血清樣品，且各試劑盒均在有效期內(nèi)并試驗(yàn)成立。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用四格表法分別對(duì)各試劑盒檢測(cè)結(jié)果與SAT進(jìn)行兩兩比較分析(表1)[5]，并利用SPSS 25.0、MedCalc 19.0等軟件將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，采用χ2檢驗(yàn)(McNemar法)對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著，采用Kappa一致性檢驗(yàn)對(duì)準(zhǔn)確性進(jìn)行分析。

表1 評(píng)價(jià)診斷試驗(yàn)的四格表

1.6 成本-效果分析 本試驗(yàn)以每份樣品檢測(cè)費(fèi)用作為成本指標(biāo)，以檢測(cè)時(shí)間(計(jì)孵育時(shí)間，加樣和洗板時(shí)間暫不計(jì)入)作為效果指標(biāo)，檢測(cè)費(fèi)用越少、檢測(cè)時(shí)間越短表明檢測(cè)效率越高。以每份樣品檢測(cè)費(fèi)用的倒數(shù)與檢測(cè)時(shí)間的倒數(shù)之積作為單位成本檢測(cè)效率值，值越大表明試劑盒越好，通過(guò)比較單位成本檢測(cè)效率值來(lái)判定各試劑盒優(yōu)劣。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)室留存的166份血清分別采用試管凝集試驗(yàn)和5個(gè)廠家布病抗體cELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

表3 5種試劑盒cELISA檢測(cè)結(jié)果

2.2 檢測(cè)結(jié)果分析 5種試劑盒的敏感性、特異性、Youden指數(shù)及AUC值見(jiàn)表4。由表4可知，廠家A、B、D敏感性最高(100.00%)；廠家C特異性最高(99.14%)。廠家A的Youden指數(shù)和AUC值最大，分別為95.69%和0.978，表明其診斷準(zhǔn)確性最好、診斷價(jià)值最高。5種試劑盒的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)、陰性預(yù)測(cè)值(NPV)和陽(yáng)性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)見(jiàn)表5。廠家A、C、E的PPV較高，表明檢出真陽(yáng)性的概率更大；廠家A、B、D的NPV均為100.00，表明檢出真陰性的概率更大。廠家C的+LR最大，表明檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性時(shí)為真陽(yáng)性的概率最大，即證實(shí)疾病的能力最強(qiáng)。廠家A、B、D的-LR均為0.00，表明檢測(cè)結(jié)果陰性時(shí)為真陰性的可能性更大，即排除疾病的能力越好。

表4 5種cELISA試劑盒敏感性、特異性、Youden指數(shù)及AUC值結(jié)果

表5 5種cELISA試劑盒陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性似然比、陰性似然比結(jié)果

2.3 符合情況分析 5種試劑盒與SAT之間的符合情況見(jiàn)表6。McNemar檢驗(yàn)結(jié)果顯示，5種試劑盒中廠家B和D的檢驗(yàn)結(jié)果與SAT結(jié)果差異顯著(P<0.05)，廠家A、C和E的檢驗(yàn)結(jié)果與SAT結(jié)果差異不顯著(P>0.05)；Kappa一致性檢驗(yàn)分析表明，5種試劑盒的檢驗(yàn)結(jié)果與SAT結(jié)果均有高度的一致性(0.790～0.930)，其中廠家A一致性最高(0.930)。

2.4 成本-效果分析 經(jīng)成本-效果分析，5種cELISA試劑盒成本-效果分析比較見(jiàn)表7，其中廠家A的效率最高。

表6 5種cELISA試劑盒血清學(xué)檢測(cè)符合情況比較

表7 5種cELISA試劑盒成本-效果分析比較

3 討論

經(jīng)檢測(cè)結(jié)果分析，廠家A、B、D敏感性最高，均為100%；廠家C特異性最高；5種試劑盒Youden指數(shù)均大于86%，表明診斷準(zhǔn)確性較好；AUC值均大于0.9，表明診斷價(jià)值較高。廠家A、C和E PPV均大于90%，表明檢出真陽(yáng)性的概率更大；5種試劑盒NPV均大于95%，表明檢出真陰性的概率較大。廠家C的+LR最大，表明證實(shí)疾病的能力最強(qiáng)；廠家A、B、D的-LR均為0，表明排除疾病的能力越好。經(jīng)Kappa一致性檢驗(yàn)分析表明，5種試劑盒與SAT結(jié)果均有高度的一致性，McNemar檢驗(yàn)結(jié)果顯示，廠家A、C和廠家E與SAT結(jié)果差異不顯著(P>0.05)；廠家B和廠家D與SAT結(jié)果差異顯著(P<0.05)。經(jīng)成本-效果分析，單位成本檢測(cè)效率值從高到低依次為A、C、B、E、D，表明廠家A的效果最好。

布病流行范圍廣、危害嚴(yán)重，是我國(guó)二類(lèi)動(dòng)物疫病。目前，常用的血清學(xué)診斷方法主要有RBT、SAT、CFT、iELISA和cELISA五種。由于敏感性和特異性的問(wèn)題，它們都缺乏“理想檢測(cè)”的質(zhì)量，而且沒(méi)有一種單一檢測(cè)方法可以適用于所有流行病學(xué)情況[6-7]。在日常檢測(cè)中以RBT和SAT為主，但2種檢測(cè)方法有較高的假陽(yáng)性(15%以上)和假陰性(10%以上)，往往出現(xiàn)漏檢和誤檢[8]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典中布病確診指定試驗(yàn)為CFT或cELISA，但由于CFT操作復(fù)雜，每次檢測(cè)需準(zhǔn)備紅細(xì)胞懸液和測(cè)定溶血素效價(jià)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力成功率又低；而ELISA操作快速、簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果客觀又可靠，且有研究證明，cELISA具有更高的特異性[6]。因此，在布病血清學(xué)確診時(shí)亦可選擇cELISA。

此外，對(duì)于不同檢測(cè)目的，選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)策略(平行試驗(yàn)或垂直試驗(yàn))也尤為重要。按照國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃和國(guó)家布病防治計(jì)劃，我國(guó)根據(jù)布病流行情況和防控策略實(shí)行區(qū)域化管理，全國(guó)多地主要采取“監(jiān)測(cè)、撲殺、隔離、消毒”等相結(jié)合的綜合性防控措施。選擇合適的監(jiān)測(cè)方案是防控布病的前提和關(guān)鍵，在監(jiān)測(cè)、凈化過(guò)程中使用2種或2種以上檢測(cè)方法互相驗(yàn)證，既可減少因誤殺造成的經(jīng)濟(jì)損失，又可降低因漏檢造成布病傳播風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，RBT和iELISA組合進(jìn)行平行試驗(yàn)敏感性最好，SAT和cELISA組合進(jìn)行垂直試驗(yàn)特異性最好[9]。

國(guó)家正在積極推進(jìn)“布病無(wú)疫區(qū)”和“布病凈化場(chǎng)群”的建設(shè)和評(píng)估驗(yàn)收，尤其是對(duì)種畜、奶畜的布病凈化。在衛(wèi)生疾病預(yù)防和治療領(lǐng)域，往往通過(guò)成本-效益分析(Cost-benefit analysis，CBA)和成本-效果分析(Cost-effectiveness analysis，CEA)來(lái)研究和評(píng)估方案、策略，從而選出最佳方案[10]。針對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的布病凈化，從生物安全經(jīng)濟(jì)學(xué)角度來(lái)看，選擇cELISA篩檢，前期檢測(cè)、人力成本會(huì)提高，但檢測(cè)結(jié)果可信度卻大大提升了，采取的針對(duì)性防控措施也更有成效，不僅可以剔除布病，還降低了養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)維護(hù)成本，對(duì)控制布魯氏菌病流行，減少經(jīng)濟(jì)損失，降低人感染疫病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。