豬SLA-1體外表達(dá)及其結(jié)合多肽的篩選

巴利民 ， 王振豹 ， 齊 鵬 ， 汪 明 ， 肖 進(jìn) ， 喻長遠(yuǎn)

(1. 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 ， 北京 朝陽 100029 ； 2. 中牧實業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點實驗室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計與制備工程技術(shù)中心 ， 北京 海淀 100095 ； 3. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

SLA分為3個類群SLA I、SLA II和SLA III。SLA I有10個基因座，其中的SLA-1、SLA-2和SLA-3為經(jīng)典的功能基因座[1]。SLA-1表達(dá)水平最高[2-3]，暗示了SLA-1分子在病毒抗原呈遞、CD8+T細(xì)胞識別甚至異種器官移植方面扮演了更加重要的角色。本試驗對豬群中表達(dá)頻率較高的豬SLA-1(SLA-1*1301)等位基因進(jìn)行原核表達(dá)純化，利用蛋白質(zhì)體外復(fù)性法進(jìn)行口蹄疫病毒抗原多肽的體外結(jié)合篩選試驗。本試驗通過高頻等位基因篩選體外結(jié)合病毒抗原多肽，有助于闡明適合該型豬的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位多肽及其遞呈規(guī)律，將為設(shè)計出依賴細(xì)胞免疫的、多種病毒病的合成肽疫苗提供科學(xué)基礎(chǔ)，另外對于加強現(xiàn)有市場口蹄疫合成肽疫苗免疫效力有重要的輔助作用。

1 材料與方法

1.1 表達(dá)載體與菌株E.coliTrans(DE3)、DH5α，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。含有豬β2m胞外成熟肽全長基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和含有豬SLA-1*1301等位基因胞外成熟肽的pET21a-β2m和pET21a-SLA-1*1301重組表達(dá)質(zhì)粒由中美泰和生物科技有限公司合成和提供。

1.2 分子生物學(xué)試劑與配制 預(yù)測多肽合成由中科亞光生物科技有限公司合成；酵母提取物、胰蛋白胨，均購自O(shè)XOID公司；L-精氨酸鹽酸鹽(L-Arginine hydrochloride)、氧化型谷胱甘肽(Glutathione oxidized,GSSG)、還原型谷胱甘肽(Glutathione reduced,GSH)以及鹽酸胍、氨芐青霉素(Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、二硫蘇糖醇(DTT)，均購自Merk公司；其他試驗所用到的試劑均為分析純試劑，購自國內(nèi)化學(xué)試劑公司。

1.3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和包涵體的提取純化 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，挑取單克隆菌落接種至100 mL氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，于搖床緩慢搖至8～10 h 后。取1%上述發(fā)酵液轉(zhuǎn)接到4 L氨芐抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，220 r/min，培養(yǎng)至OD值為0.4～0.6后，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，170 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)5 h。發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min離心3 min，棄上清液，用40～60 mL PBS進(jìn)行懸浮，懸浮混勻的菌體進(jìn)行超聲裂解。超聲后的菌液4 ℃， 12 000 r/min離心10 min后，可見白色致密菌塊即為包涵體。Washing Buffer 20 mL懸浮沉淀，4 ℃， 12 000 r/min離心10 min，倒掉上清。取新的50 mL的離心管稱重預(yù)冷備用，將離心后的樣品倒掉Washing Buffer，用Resuspension Buffer約20 mL懸浮并將懸浮液轉(zhuǎn)至已稱重的新的離心管中。4 ℃， 12 000 r/min離心10 min，棄去上清，按30 mg/mL 用鹽酸胍溶解包涵體，并在4 ℃條件下攪拌均勻。最后在4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min， 將上清液分裝成每管1 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白的復(fù)性和純化

1.4.1 蛋白復(fù)性 配制50 mL Refolding Buffer，4 ℃ 冰箱預(yù)冷后加入GSH和GSSG。復(fù)性過程在4 ℃ 條件下進(jìn)行。將轉(zhuǎn)子放在裝有Refolding Buffer 的150 mL燒杯中，置于磁力攪拌器上，并設(shè)置350 r/min 的轉(zhuǎn)速。吸取100 μL β2m包涵體緩緩滴入Refolding Buffer內(nèi)。攪拌2 h后直接加入15 μL DMSO溶解的多肽；30 min后，將300 μL SLA-1*1301重鏈包涵體分3次緩緩滴入Refolding Buffer內(nèi)，每次間隔30 min左右，4 ℃冰箱復(fù)性12 h。

1.4.2 蛋白濃縮 將復(fù)性液轉(zhuǎn)移至15 mL的超濾濃縮管中(截留分子量為10 kDa)。4 ℃，2 400 r/min于水平離心機上濃縮，濃縮至1 mL以下，加入5倍體積配好的分子篩緩沖液換液，繼續(xù)濃縮至體積在1 mL 以下。吸取濃縮好的蛋白至1.5 mL的離心管中，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，準(zhǔn)備上樣。

1.4.3 分子篩層析 蛋白濃縮好以后，將SuperdexTM200 increase 10/300 GL凝膠層析柱組裝到高效液相色譜儀(HPLC)上，用預(yù)冷的分子篩 Buffer平衡凝膠層析柱，調(diào)節(jié)柱壓至3 MPa，流速為0.7 mL/min， 大約35 min后平衡好。此時可設(shè)定相關(guān)參數(shù)。將EP管中準(zhǔn)備好的蛋白樣品緩慢吸入AKTA 快速蛋白液相色譜(FPLC)進(jìn)行分子篩層析。在層析柱上根據(jù)柱壓設(shè)置相應(yīng)的流速，收集相應(yīng)分子量的目的峰處的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和濃縮備用。

2 結(jié)果

2.1 SLA-1*1301(α1～α3區(qū))及SLA-β2m表達(dá)載體構(gòu)建 對SLA-1*1301胞外區(qū)及SLA-β2m基因序列分別進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的序列委托中美泰和生物科技有限公司合成，合成后的片段直接連接到本實驗室保存的pET21a(+)原核表達(dá)載體上，構(gòu)建出SLA-1*1301(α1～α3區(qū))及SLA-β2m表達(dá)載體。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑取單克隆，利用LB培養(yǎng)后再提質(zhì)粒進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果分析后確認(rèn)正確無誤。

2.2 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) pET21a-SLA-1*1301與pET21a-SLA-β2m使用4 L的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá)，IPTG終濃度為1 mmol/L，37 ℃搖床170 r/min 誘導(dǎo)5 h。收集菌體對其進(jìn)行破碎，離心分離包涵體，對包涵體進(jìn)行純化，SDS-PAGE鑒定純度如圖1、2所示，顯示提取純化的SLA-1*1301和SLA-β2m蛋白包涵體純度較好。

圖1 SLA-1*1301表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖2 SLA-β2m表達(dá)的SDS-PAGE分析

2.3 體外多肽的篩選 利用http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/軟件對豬口蹄疫病毒序列進(jìn)行預(yù)測分析，獲得6條可能的CTL表位，具體見表1。

SLA-1*1301(α1～α3區(qū))蛋白、SLA-β2m蛋白和預(yù)測多肽分別共復(fù)性、濃縮，通過蛋白純化儀純化檢測結(jié)果如圖3。由圖3可以看出，體外復(fù)性試驗鑒定多肽GD-1、GD-2、GD-4和GD-6的圖譜在流出15 mL處，均有明顯的尖峰出現(xiàn)，表明這些多肽抗原與豬SLA-1*1301分子有很強的結(jié)合能力，這些多肽是含有該SLA-1型豬的有效CTL表位。多肽GD-3和GD-5鑒定圖譜15 mL處未出現(xiàn)明顯的尖峰，表明結(jié)合力不強，不能產(chǎn)生較強的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖3 體外復(fù)性試驗鑒定多肽與SLA-1*1301分子的結(jié)合能力

3 討論

20世紀(jì)80年代，Townsend等首次提出了流感病毒源性的多肽孵育未感染的淋巴細(xì)胞之后，流感病毒特異性的T細(xì)胞能夠?qū)@些淋巴細(xì)胞實現(xiàn)殺傷[4]。通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析，研究者發(fā)現(xiàn)這些抗原短肽在參與抗原識別與遞呈，激活免疫應(yīng)答過程中起到關(guān)鍵作用。這些短肽現(xiàn)在被證實為可以激發(fā)細(xì)胞免疫的CTL表位，對感染病毒的細(xì)胞起到殺傷作用?，F(xiàn)有研究表明，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞必須有TCR與MHC I-多肽三分子復(fù)合物提供的抗原識別信號，此為該細(xì)胞被激活的第一信號。因而通過構(gòu)建MHC I-表位多肽復(fù)合體來鑒定CTL表位多肽有很重要的意義。

目前國內(nèi)外豬口蹄疫疫苗主要為滅活疫苗和合成肽疫苗2種。這2種疫苗均為體液免疫為主的防護(hù)疫苗，很難激發(fā)細(xì)胞免疫。尤其是新型的豬口蹄疫合成肽疫苗的研究主要集中于B細(xì)胞表位肽疫苗，即使T細(xì)胞表位研究也主要著眼于通用T-helper 表位[5]。而對SLA I分子遞呈的CTL細(xì)胞表位的研究很少，更缺乏其CTL細(xì)胞表位合成肽疫苗的相關(guān)研究報道。本文前期通過大量豬群SLA I等位基因分析，并成功表達(dá)豬群中分布比較高的SLA-1(SLA-1*1301)等位基因，通過體外構(gòu)建SLA I-β2m-表位多肽復(fù)合體的方法篩選出了4條可能的口蹄疫CTL表位，為開發(fā)口蹄疫CTL表位多肽疫苗提供科學(xué)依據(jù)，具有較好的開發(fā)前景。