羊布魯氏菌病膠體金抗體檢測(cè)方法的建立

王海麗 ， 董炳梅 ， 李 芬 ， 許崇友 ， 王金良

(1.聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧科技系 ， 山東 聊城 252000 ； 2.臨清潤林牧業(yè)有限公司 ， 山東 聊城 252000 ； 3.山東綠都生物科技有限公司 ， 山東 濱州 256600 ； 4.日照市東港區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 山東 日照 276800 ； 5.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 ， 山東 濱州 256600)

布魯氏菌病(Brucellosis)是一種人獸共患病，嚴(yán)重危害人、畜健康，該病由布魯氏菌(Brucellasp.)引起，可導(dǎo)致豬、牛、羊等多種動(dòng)物的不育、流產(chǎn)、關(guān)節(jié)腫大以及人的反復(fù)高熱、游走性疼痛，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。我國布魯氏菌病被列為二類傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類傳染病。

目前，我國布魯氏菌病的法定檢測(cè)方法是病原學(xué)檢測(cè)與血清學(xué)診斷方法，包括凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、PCR檢測(cè)和ELISA檢測(cè)等。凝集試驗(yàn)與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)均存在非特異性反應(yīng)、假陽性或前帶現(xiàn)象等不足 ； PCR檢測(cè)與ELISA檢測(cè)等方法雖敏感性高、特異性強(qiáng)，但需要特殊儀器和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。因此，以上方法不能滿足對(duì)布魯氏菌病的現(xiàn)場(chǎng)診斷與防控需求。膠體金免疫層析(GICA)技術(shù)是在免疫滲濾技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，適于臨床樣本的檢測(cè)[3]。

布魯氏菌細(xì)胞膜是一個(gè)三層膜的結(jié)構(gòu)，其中OMP25在維持外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細(xì)菌毒力等生物學(xué)特性方面起到重要作用，是布魯氏菌的重要膜蛋白之一[4]。本試驗(yàn)在克隆表達(dá)布魯氏菌OMP25蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開發(fā)了布魯氏菌GICA檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及血清抗體 羊布魯氏菌陰性、陽性標(biāo)準(zhǔn)血清，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌、巴氏桿菌、沙門菌免疫血清、豬種布魯氏菌S2株、重組質(zhì)粒pET-OMP25，均由濱州畜牧獸醫(yī)研究院制備保存。

1.1.2 主要材料與儀器 金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA，ProSpec公司)；膠體金噴點(diǎn)平臺(tái)系統(tǒng)(美國Biodot公司，型號(hào)：ZX1000)；可編程切條機(jī)(杭州峰航科技有限公司，型號(hào)：HGS201)；樣品墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NCM)、吸水墊及背襯等試紙條組裝材料(Millipore公司)；GST標(biāo)簽蛋白親和層析純化柱(Amersham Biosciences公司)；透射電子顯微鏡(Tokyo公司)；BCA法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌外膜蛋白OMP25的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pET-OMP25轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌，37 ℃搖菌培養(yǎng)至OD600 nm值達(dá)0.6時(shí)，加IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)16 h后，進(jìn)行超聲裂解。表達(dá)的OMP25蛋白通過親和柱層析的方法進(jìn)行純化，BCA法對(duì)純化后的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行凍干后保存。

1.2.2 膠體金的制備 在容積為500 mL錐形瓶中加入100 mL三蒸水，通過磁力加熱攪拌器的方式攪拌加熱至沸騰后，加入濃度為1%的HAuCl4溶液1 mL， 持續(xù)加熱2～3 min后，快速加入1.8 mL 濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，待溶液變?yōu)榱良t色后，繼續(xù)攪拌加熱10 min，自然冷卻至室溫，用三蒸水補(bǔ)充體積至100 mL，2～8 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SPA標(biāo)記pH的確定 溶液的pH對(duì)于膠體金顆粒吸附蛋白起到非常重要的作用，在實(shí)際的膠體金探針標(biāo)記中，一般將標(biāo)記體系的pH調(diào)整為高于被標(biāo)記蛋白等電點(diǎn)(pI)0.5時(shí)，即pH=pI+0.5，在這種pH條件下蛋白帶正電，結(jié)合更穩(wěn)定。

1.2.4 蛋白標(biāo)記用量的確定 取10支1.5 mL Ep管，每支加入新制備的膠體金溶液1 mL，然后依次加入不同量的SPA蛋白，混勻后靜置5 min，依次向各管中加入0.1 mL 10%(w/v)的NaCl溶液(表1)，充分混勻后室溫靜置，2 h后觀察反應(yīng)溶液顏色改變情況。當(dāng)SPA加入量不足時(shí)，溶液為藍(lán)色；當(dāng)SPA蛋白加入適量或過量，溶液則保持顏色不變，即為紅色。在探針制備過程中，蛋白的加入量一般為測(cè)定最小標(biāo)記濃度的130%。

1.2.5 SPA蛋白膠體金標(biāo)記物的制備 將新制備的20 mL膠體金溶液加入至50 mL燒杯中，用0.1 mol/L K2CO3溶液調(diào)整pH至1.2.3中確定的pH，緩慢攪拌的同時(shí)逐滴加入1.2.3中測(cè)定的1.3倍的SPA蛋白用量后，繼續(xù)攪拌30 min；再加入BSA至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30 min；2～8 ℃靜置2 h后，2 000 r/min離心15 min,棄沉淀,上清以8 000 r/min 再次離心45 min后，棄去上清液，取沉淀用標(biāo)記洗滌液復(fù)溶至原體積；再次以10 000 r/min離心30 min后，用2 mL標(biāo)記洗滌液復(fù)溶沉淀，2～8 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 SPA蛋白標(biāo)記量的確定

1.2.6 樣品墊、金標(biāo)墊制備 (1)樣品墊的制備：切割好的吸水墊用封閉液均勻浸潤后，取出平放于37 ℃干燥箱烘干，期間進(jìn)行翻轉(zhuǎn)2～3次;(2)金標(biāo)墊的制備：切割好的玻璃纖維膜浸潤封閉液后，放入37 ℃干燥箱烘干，期間進(jìn)行翻轉(zhuǎn)2～3次,濃縮好的金標(biāo)記物進(jìn)行4倍稀釋后，均勻涂抹在已經(jīng)進(jìn)行過封閉的玻璃纖維膜上，進(jìn)行真空冷凍抽干,抽干后的金標(biāo)墊室溫密封存于干燥環(huán)境中，備用。

1.2.7 硝酸纖維素膜(NCM)的處理 將布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、OMP25蛋白抗原按照篩選的濃度，用點(diǎn)膜儀依次間隔4 mm在NCM上劃線，分別作為質(zhì)控線、檢測(cè)線，37 ℃干燥后于10% BSA PBS溶液中37 ℃封閉15 min，再次干燥后備用。

1.2.8 膠體金試紙的組裝及結(jié)果判定 如圖1所示，將金標(biāo)墊、樣品墊和吸水墊依次粘貼到硝酸纖NCM上，在NCM上已將檢測(cè)線和質(zhì)控線進(jìn)行了蛋白包被。

結(jié)果判定：試紙條的質(zhì)控線(C線)和檢測(cè)線(T線)出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色條帶，結(jié)果判為陽性；在有效時(shí)間內(nèi)，T線顏色深淺與被檢血清中的抗體效價(jià)高低呈正相關(guān)。C線出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色條帶，而T線無肉眼可見的紫紅色條帶，結(jié)果判為陰性。C線無條帶出現(xiàn)則判為無效檢測(cè)。如中插彩版圖2所示。

圖1 免疫層析試紙條示意圖

1.2.9 檢測(cè)樣品稀釋比例的確定 將布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性、陰性血清，依次用0.85%生理鹽水進(jìn)行10、20、40、60、80倍和100倍稀釋，樣本最佳稀釋倍數(shù)根據(jù)質(zhì)控線和檢測(cè)線的顯色深度進(jìn)行確定。

1.2.10 試紙條特異性檢驗(yàn) 用研制的試紙條，依次檢測(cè)布魯氏菌陽性血清、布魯氏菌陰性血清、0.85%生理鹽水、大腸桿菌陽性血清、鏈球菌陽性血清、巴氏桿菌陽性血清、沙門菌陽性血清、葡萄球菌陽性血清。加樣量為100 μL，樣品稀釋倍數(shù)依據(jù)1.2.9中的結(jié)果進(jìn)行，質(zhì)控線顯色后10 min內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.11 試紙條敏感性比較 采用試紙條和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法，同時(shí)檢測(cè)倍比稀釋后的布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，比較2種方法的敏感性。

1.2.12 批內(nèi)與批間的差異性檢測(cè) 對(duì)20份臨床血清樣品，用3個(gè)不同批次的試紙條分別進(jìn)行布魯氏菌血清抗體檢測(cè)，比較分析試紙條檢測(cè)結(jié)果的批間差異性。隨機(jī)在一個(gè)批次的試紙條中取20個(gè)試紙條檢測(cè)卡，檢測(cè)同一份臨床血清樣品，評(píng)價(jià)試紙條檢測(cè)批內(nèi)差異性。

1.2.13 保存期試驗(yàn) 20組試紙條，每組10個(gè)，密封干燥包裝后，分別放在室溫和4 ℃保存3個(gè)月后，每個(gè)月取出5條試紙條，分別評(píng)價(jià)在室溫和4 ℃保存條件下，試紙條的特異性和敏感性的差異情況。

1.2.14 臨床檢測(cè)應(yīng)用 隨機(jī)抽取320份從山東、河南等地的送檢的羊血清樣品，用本試驗(yàn)研制的試紙條檢測(cè)布魯氏菌血清抗體。并與購買的布魯氏菌抗體ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)隨機(jī)采集的20份臨床血清樣品，比較布魯氏菌抗體ELISA試劑盒和研制試紙條檢測(cè)結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌 OMP25蛋白的表達(dá)及純化 將OMP25蛋白表達(dá)并純化后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示，蛋白大小約為25 kDa，蛋白濃度為1.41 mg/mL，且具有較高的純度(圖3)。

2.2 膠體金的制備 透射電鏡對(duì)制備的膠體金顆粒進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果顯示，膠體金顆粒較為均一(圖4)；制備的膠體金溶液在400～600 nm紫外掃描得到最大吸收峰波長為520 nm(圖5)，膠體金顆粒直徑約為20 nm，與透射電鏡觀測(cè)值基本相符。

2.3 SPA蛋白標(biāo)記膠體金溶液的pH 膠體金溶液的pH根據(jù)SPA的pI確定。SPA的pI為5.1，在膠體金探針制備中，膠體金調(diào)整為pH=pI+0.5。因此，膠體金溶液的pH確定為5.6。

圖3 OMP25蛋白的表達(dá)與純化

圖4 膠體金顆粒觀測(cè)圖

圖5 膠體金溶液在400～600 nm紫外掃描圖譜

2.4 SPA蛋白標(biāo)記物濃度 從中插彩版圖6中顏色變化可以看出，加入6 μg SPA蛋白的7號(hào)管，再加入10%NaCl后，膠體金溶液顏色未有明顯變化，而8號(hào)管溶液的顏色變?yōu)樗{(lán)色，表明7號(hào)管SPA量適宜或超量。在實(shí)際工作中，加入蛋白濃度一般為測(cè)定標(biāo)記蛋白濃度的1.3倍，因此確定最佳SPA標(biāo)記物的濃度為7.8 μg/mL。

2.5 檢測(cè)線和質(zhì)控線包被濃度的確定 不同的檢測(cè)線和質(zhì)控線、包被濃度，對(duì)試紙條的特異性和敏感性有很大的影響。經(jīng)多次試驗(yàn)，通過目測(cè)質(zhì)控線和檢測(cè)線顯色清晰度，最終確定如下條件：檢測(cè)線包被條件：OMP25蛋白的濃度為1.20 mg/mL，點(diǎn)膜儀參數(shù)為Speed 40 mm/sec，1.0 μL/cm；質(zhì)控線包被條件：羊IgG的濃度為1.60 mg/mL，點(diǎn)膜儀參數(shù)為Speed 40 mm/sec，1.0 μL/cm。

2.6 血清樣本稀釋倍數(shù)的確定 通過將多份不同倍數(shù)稀釋后布魯氏菌陰、陽性血清及大腸桿菌免疫血清、巴氏桿菌免疫血清、沙門菌免疫血清進(jìn)行試紙條檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行20倍稀釋后，血清樣本在T線和C線上的顯色最為清晰。并且其他血清在進(jìn)行稀釋檢測(cè)后，未發(fā)生非特異性反應(yīng)。因此，確定20倍稀釋為待檢樣品最佳稀釋倍數(shù)。

2.7 試紙條特異性檢驗(yàn) 結(jié)果見中插彩版圖7，由圖7可知，本試驗(yàn)所制備的布魯氏菌抗體檢測(cè)試紙條具有很好的特異性，僅與布魯氏菌陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而與布魯氏菌陰性血清、0.85%生理鹽水、大腸桿菌陽性血清、巴氏桿菌陽性血清、沙門菌陽性血清、鏈球菌陽性血清、葡萄球菌陽性血清無交叉反應(yīng)，重復(fù)3次，結(jié)果相同。可以進(jìn)行下一步測(cè)試。

2.8 試紙條敏感性檢驗(yàn) 用制備的試紙條和西班牙INgezim公司的布魯氏菌病抗體ELISA檢測(cè)倍比稀釋后的布魯氏菌陽性血清，結(jié)果表明，二者的最低檢出量均在1∶1 280～1∶2 560，證明2種檢測(cè)方法的敏感性相近(表2)。

2.9 試紙條臨床應(yīng)用及符合率試驗(yàn) 在臨床收集的320份樣本血清中，ELISA試劑盒檢測(cè)的布魯氏菌抗體陽性率為89.7%，膠體金試紙條檢測(cè)的抗體陽性率為85.9%。ELISA試劑盒共檢測(cè)出陽性287份，試紙條共檢測(cè)出陽性275份；用ELISA試劑盒檢測(cè)出的33份陰性樣品中，利用膠體金試紙條檢測(cè)出32份陰性樣品(表3)。相同樣本2種檢測(cè)方法的符合率為95.9%，敏感性為95.8%，特異性為97.0%。證明該膠體金試紙條的檢測(cè)結(jié)果是可靠的。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn)和保存期試驗(yàn) 用3個(gè)不同批次的試紙條分別檢測(cè)20份臨床血清，結(jié)果完全一致，表明研制試紙條的批間差異較小。隨機(jī)從一批試紙條中挑取的20條，檢測(cè)同一份臨床血清樣品，檢測(cè)結(jié)果完全一致，說明試紙條批內(nèi)無差異。保存期試驗(yàn)表明，在4 ℃條件下保存9個(gè)月，試紙條的敏感性和特異性無明顯變化，敏感性在試紙條保存10個(gè)月時(shí)有所降低；在室溫條件下保存6個(gè)月，試紙條的敏感性和特異性無明顯變化，敏感性在試紙條保存7個(gè)月時(shí)有所降低。結(jié)果表明：試紙條在4 ℃條件下密閉保存9個(gè)月或室溫下保存6個(gè)月，其敏感性和特異性不發(fā)生改變，可用于臨床檢測(cè)。

表2 間接ELISA檢測(cè)、膠體金試紙條方法的敏感性比較

表3 臨床血清樣品檢測(cè)結(jié)果符合率比較

3 討論

GICA技術(shù)廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景[5]。目前根據(jù)膠體金標(biāo)記物的不同反應(yīng)模式有3種：間接法、夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法。間接法膠體金試紙條主要用于抗體檢測(cè)，夾心法膠體金試紙條主要用于大分子抗原的檢測(cè)；競(jìng)爭(zhēng)法多用于小分子抗原的檢測(cè)。試紙條除了具有很好的敏感性和特異性之外，還具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、無需其他特殊反應(yīng)試劑等優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果易于判斷，10 min左右即可進(jìn)行判定。

本試驗(yàn)在克隆表達(dá)布魯氏菌OMP25蛋白的基礎(chǔ)上，建立了布魯氏菌抗體間接膠體金檢測(cè)方法。臨床應(yīng)用表明，本試驗(yàn)所制備的試紙條與進(jìn)口的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒符合率為95.9%，敏感性為95.8%，特異性為97.0%。證明膠體金試紙條的檢測(cè)結(jié)果是可靠的，可以代替ELISA、凝集反應(yīng)與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等方法用于布魯氏菌抗體水平的檢測(cè)，可作為羊布魯氏菌的流行病學(xué)調(diào)查的工具。